闞 桐，王 越，王瑞剛

0 引言

腦梗死發(fā)病率與死亡率逐年上升，氧化應激、神經(jīng)細胞凋亡率增加是誘導腦梗死發(fā)生的重要原因[1-2]。氧糖剝奪/復氧損傷(OGD/R)誘導的神經(jīng)細胞可作為探究腦缺血再灌注損傷的模型[3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigalocatechin gallate，EGCG)屬于綠茶茶多酚的主要成分，EGCG具有抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷的作用[4]。長鏈非編碼RNA MALAT1(Long non-coding RNA MALAT1，lncRNA MALAT1)可通過上調(diào)miR-146a的表達抑制MALAT1的表達，從而抑制炎癥反應[5]。生物信息學分析顯示，微小RNA-2115-3p (microRNA-2115-3p，miR-2115-3p)可能是MALAT1的靶基因，2型糖尿病伴嚴重肢體缺血的患者中miR-2115-3p上調(diào)[6]。本研究采用OGD/R處理神經(jīng)細胞建立細胞損傷模型，探討EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡、氧化應激的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 EGCG購自大連美侖生物技術有限公司(批號：MB1672，純度：95%)；大鼠海馬神經(jīng)元細胞HT22(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑與Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；miR-2115-3p寡核苷酸模擬物(miR-2115-3p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、MALAT1小分子干擾RNA(si-MALAT1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialedhyde，MDA)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司；RIPA裂解液購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 神經(jīng)細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基，待細胞生長至80%融合度時，使用0.25%胰蛋白酶消化，加入DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3×104個/ml，按照每孔150 μl的密度將細胞接種于96孔板，分別進行氧糖剝奪4 h處理，隨后更換DMEM完全培養(yǎng)基復氧處理24 h[7]，將進行氧糖剝奪/復氧損傷(OGD/R)的細胞作為OGD/R組。同時將正常培養(yǎng)的細胞作為Con組。分別使用不同濃度(25、50、100 μmol/L)的EGCG處理神經(jīng)細胞24 h[8]，隨后進行OGD/R處理，分別記作EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組。將培養(yǎng)基更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基，參照Lipofectamine2000試劑盒說明書分別將pcDNA、pcDNA-MALAT1轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細胞，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為DMEM完全培養(yǎng)基，使用濃度為100 μmol/L的EGCG處理24 h，隨后進行OGD/R處理，分別記作EGCG-H+pcDNA組、EGCG-H+pcDNA-MALAT1組。

1.2.2 檢測SOD、MDA含量 收集各組細胞，預冷PBS洗滌，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清，參照試劑盒說明書分別檢測SOD、MDA的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組對數(shù)生長期神經(jīng)細胞，預冷PBS洗滌，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，相同條件下使用PBS洗滌3次，棄上清，收集細胞沉淀，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，依次分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫振蕩孵育10 min，應用FACS Calibur流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞中MALAT1、miR-2115-3p的表達水平 取各組對數(shù)生長期神經(jīng)細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA合成cDNA。MALAT1正向引物5′-CCCCTGGGCTTCTCTTAACA-3′，反向引物5′-TAGATCAAAAGGCACG GGGT-3′；miR-2115-3p正向引物5′-TTGTCCTTCATTCCACCGGA-3′，反向引物5′-TACAT GTTCCCACCCAGCAT-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。參照實時熒光定量PCR試劑盒配置反應體系，反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循環(huán)。MALAT1以GAPDH為內(nèi)參，miR-2115-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算MALAT1、miR-2115-3p相對表達量。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測MALAT1的靶基因 starBase預測顯示MALAT1與miR-2115-3p存在結(jié)合位點，由此推測MALAT1可能靶向調(diào)控miR-2115-3p，利用基因突變技術將結(jié)合位點進行突變，分別將含有結(jié)合位點與突變位點的序列插入熒光素酶報告基因載體分別構建野生型載體WT-MALAT1、突變型載體MUT-MALAT1。分別將miR-NC、miR-2115-3p mimics與WT-MALAT1、MUT-MALAT1共轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細胞，檢測各組細胞相對熒光素酶活性。分別將pcDNA、pcDNA-MALAT1、si-NC、si-MALAT1轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細胞，采用qRT-PCR檢測各組細胞中miR-2115-3p的表達水平。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Bax、Bcl-2蛋白表達 收集各組對數(shù)生長期神經(jīng)細胞，加入400 μl RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白變性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入Bax (1∶1 000)、Bcl-2 (1∶1 000)與內(nèi)參蛋白GAPDH (1∶1 000)一抗稀釋液，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL，顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞氧化應激的影響 與Con組比較，OGD/R組SOD含量降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；與OGD/R組比較，EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組SOD含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組間SOD、MDA含量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞氧化應激的影響(n=9)

2.2 EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響 與Con組比較，OGD/R組細胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與OGD/R組比較，EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細胞凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細胞凋亡率與Bax、Bcl-2蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、表2。

2.3 EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞中MALAT1、miR-2115-3p表達量的影響 與Con組比較，OGD/R組細胞中MALAT1的表達水平升高(P<0.05)，miR-2115-3p的表達水平降低(P<0.05)；與OGD/R組比較，EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細胞中MALAT1的表達水平降低(P<0.05)，miR-2115-3p的表達水平升高(P<0.05)，且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組間MALAT1、miR-2115-3p的表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

圖1 EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響

表2 EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響(n=9)

2.4 MALAT1靶向調(diào)控miR-2115-3p starBase預測顯示，MALAT1的序列中含有與miR-2115-3p互補的核苷酸序列，見圖2。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-MALAT1的細胞實驗中，與miR-NC組比較，miR-2115-3p組熒光素酶活性降低(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-MALAT1的細胞實驗中，miR-2115-3p組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。與pcDNA組比較，pcDNA-MALAT1組細胞中miR-2115-3p表達降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-MALAT1組細胞中miR-2115-3p的表達水平升高(P<0.05)，見表5。

表3 EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞中MALAT1、miR-2115-3p表達量的影響(n=9)

圖2 MALAT1的序列中含有與miR-2115-3p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗(n=9)

表5 MALAT1靶向調(diào)控miR-2115-3p的表達(n=9)

2.5 MALAT1過表達降低EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞氧化應激及凋亡的作用 與EGCG-H+pcDNA組比較，EGCG-H+pcDNA-MALAT1組細胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，SOD含量降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)，見圖3、表6。

圖3 MALAT1過表達降低EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡的作用注：A.流式細胞術檢測細胞凋亡率，B.Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達

表6 MALAT1過表達降低EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞氧化應激及凋亡的作用(n=9)

3 討論

腦梗死患者腦部缺血后神經(jīng)細胞凋亡率明顯升高，進而導致腦功能損傷甚至死亡，已嚴重影響患者生命安全。既往研究顯示，人參皂苷、三七總皂苷、紅景天苷等中醫(yī)藥物對缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡等具有一定抑制作用[9-11]。但仍有部分中醫(yī)藥物在腦梗死治療過程中的作用機制尚未闡明。因此，本研究積極探尋新型缺血性腦部疾病治療藥物并探究其可能作用機制，為提高患者的治療效果提供新方向。

EGCG可通過抑制過氧化氫的生成及清除氧自由基等，對心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用，還可通過抑制心肌細胞凋亡減緩心肌缺血再灌注損傷[12-13]。研究表明，EGCG在一定程度上可抑制神經(jīng)元凋亡，從而對繼發(fā)性脊髓損傷發(fā)揮保護作用[14]。但關于EGCG對缺血再灌注損傷誘導的神經(jīng)細胞凋亡的作用機制尚未完全闡明。氧化應激主要是指機體氧化與抗氧化能力失衡，氧自由基的大量生成可促使腦缺血再灌注神經(jīng)細胞凋亡，抑制氧自由基的生成可抑制氧化應激反應，從而達到治療再灌注損傷的目的。研究表明，OGD/R可誘導神經(jīng)細胞中活性氧的生成量增加，SOD可清除氧自由基，從而減弱缺血損傷導致的神經(jīng)細胞凋亡，而MDA屬于脂質(zhì)類過氧化物，并可促進氧自由基的生成[15-17]。本研究結(jié)果顯示，OGD/R處理后，神經(jīng)細胞中SOD含量降低，MDA含量升高，提示OGD/R誘導神經(jīng)細胞氧化應激反應、OGD/R誘導的神經(jīng)細胞損傷模型建模成功。本研究采用不同濃度的EGCG處理后，OGD/R誘導的神經(jīng)細胞中SOD含量升高，MDA含量降低，且隨著EGCG使用劑量的增加而顯著變化，提示EGCG可抑制OGD/R誘導的神經(jīng)細胞氧化損傷，且呈劑量依賴效應。研究表明，Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bax表達上調(diào)可促進線粒體釋放細胞色素C而激活caspase級聯(lián)反應，從而促進細胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，OGD/R處理后，神經(jīng)細胞凋亡率顯著升高，Bax表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)，而不同濃度的EGCG處理后，神經(jīng)細胞凋亡率顯著降低，Bax表達下調(diào)，Bcl-2表達上調(diào)，且呈劑量依賴效應。提示EGCG可抑制OGD/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡。

MALAT1可通過促進SAA3表達而增強LPS誘導的膿毒性心肌細胞炎癥反應[19]。MALAT1通過調(diào)控miR-150-5p/NF-κB分子軸，在敗血癥誘發(fā)的心臟炎癥反應中發(fā)揮重要作用[20]。本研究結(jié)果顯示，OGD/R誘導的神經(jīng)細胞中MALAT1表達水平升高，miR-2115-3p的表達水平降低，而不同濃度的EGCG處理后神經(jīng)細胞中MALAT1的表達水平降低，miR-2115-3p的表達水平升高，且呈劑量依賴效應。進一步分析顯示，MALAT1可靶向結(jié)合miR-2115-3p，并可負向調(diào)控miR-2115-3p的表達，提示EGCG可能通過下調(diào)MALAT1的表達及上調(diào)miR-2115-3p的表達從而減輕OGD/R誘導的神經(jīng)細胞損傷。為驗證上述推測，本研究將MALAT1過表達載體轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細胞，使用EGCG處理后進行OGD/R處理，結(jié)果顯示，miR-2115-3p的表達水平降低，細胞凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，SOD含量降低，MDA含量升高，說明MALAT1過表達降低EGCG對OGD/R誘導的神經(jīng)細胞氧化應激及凋亡的作用。提示EGCG可通過調(diào)控MALAT1/miR-2115-3p分子軸，從而抑制OGD/R誘導的神經(jīng)細胞氧化應激及凋亡。

綜上所述，EGCG可抑制OGD/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡及減輕細胞氧化損傷，其作用機制與調(diào)控MALAT1/miR-2115-3p分子軸有關，可為缺血性腦疾病的治療提供新方向，還可為進一步揭示EGCG在缺血性腦疾病治療中的作用機制提供實驗依據(jù)。