胡新

（甘孜藏族自治州州人民醫(yī)院檢驗科，四川 甘孜 626000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium Tuberculosis，MTB）引起的全身多器官系統(tǒng)感染性疾病，以肺結(jié)核最為常見[1]。由于結(jié)核的治療一般需要多種藥物聯(lián)合使用，長期規(guī)律治療，并且在治療中可能會存在耐藥，因此選擇合適的方法快速、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核及耐藥情況是患者治療開展的基礎(chǔ)[2]。GeneXpert MTB/RIF Asaay檢測系統(tǒng)系統(tǒng)是由美國Cepheid公司研發(fā)，將樣品準(zhǔn)備、定量PCR擴(kuò)增和熒光檢測集于一身并自動進(jìn)行MTB核酸分析的系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用半巢式實時熒光定量PCR，針對rpoB基因81 bp利福平（Rifampicin，RIF）耐藥區(qū)間設(shè)計引物、探針，檢測其是否有突變，能夠在2 h內(nèi)檢測出患者是否感染結(jié)核或?qū)Ｆ侥退?，很大程度滿足臨床需求[3]。基于此，本研究選取2019年1月至2019年12月在甘孜藏族自治州人民醫(yī)院住院的臨床癥狀和影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本148份，同時選取50份肺部感染（非結(jié)核感染）的痰液標(biāo)本，采用GeneXpertMTB/RIF Assay以及傳統(tǒng)的涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT960檢測法對結(jié)核桿菌進(jìn)行測定，旨在探討GeneXpertMTB/RIF Assay檢測法的優(yōu)點，現(xiàn)將研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2019年12月在甘孜藏族自治州人民醫(yī)院住院的臨床癥狀和影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本148份，同時選取50份肺部感染（非結(jié)核感染）的痰液標(biāo)本；分別采用涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT960檢測法和GeneXpertMTB/RIF檢測法檢測痰液標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌表達(dá)情況，并分別采用MGIT960藥敏法和GeneXpertMTB/RIF檢測法測定MTB對RIF耐藥的情況。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

所有患者均符合肺結(jié)核的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并經(jīng)影像學(xué)及細(xì)菌學(xué)檢查確診；未合并其他肺部疾病。

1.3 儀器與試劑

抗酸染液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供；羅氏固體培養(yǎng)基與分枝桿菌培養(yǎng)添加劑、培養(yǎng)管以及分枝桿菌用聯(lián)合藥敏試劑盒和痰消化液均由碧迪醫(yī)療器械有限公司提供；BACTECMIT960、全自動GeneXpert儀器及GeneXpert Mtb/RIF檢測試劑盒GeneXpert MTB/RIF Asaay檢測系統(tǒng)均購自美國Cepheid公司。儀器包括四通道半巢式熒光定量PCR分析儀，計算機(jī)及操作系統(tǒng)軟件、KDC-2046低速冷凍離心機(jī)。

1.4 方法

1.4.1 MGIT960檢測MTB及MGIT960藥敏法

痰液標(biāo)本加入等量體積4%氫氧化鈉溶液，置震蕩器振蕩液化15 s后，孵育不超過20 min，加入PBS后振蕩離心（3950 r·min-1，15 min，離心半徑8 cm）后棄上清液，加入PBS 2 ml混勻，取0.5 ml標(biāo)本處理液上機(jī)測試，若結(jié)果為陽性，則挑選陽性菌落涂片、轉(zhuǎn)種于羅氏培養(yǎng)基；取出陽性第3天～第5天培養(yǎng)管，取1 ml標(biāo)本液和4 ml無菌生理鹽水作為稀釋菌液，再以此稀釋菌液1∶100稀釋作為對照菌液，分別加入500 μl對照菌液和稀釋菌液于BACTEC MGIT960對照管及加有RFP的藥物培養(yǎng)管中顛倒混勻。放入BACTEC MGIT960培養(yǎng)箱中，15 d內(nèi)儀器自動報告敏感與耐藥結(jié)果。

1.4.3 GeneXpertMTB/RIF Assay檢測法

（1）前處理：取1 ml痰標(biāo)本于樣品管中，加入2倍體積的SR，震蕩20 s后靜置15min。取2 ml處理后樣本液，加入Cartrige反應(yīng)盒內(nèi)。

（2）檢測：將含標(biāo)本液的Cartrige盒放入模塊中，系統(tǒng)自動進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增，以及目標(biāo)序列的檢測和結(jié)果判斷。反應(yīng)結(jié)束后判讀痰液標(biāo)本中是否存有MTB以及是否對RIF耐藥。

（3）GeneXpertMTB/RIF檢測法對MTB的結(jié)果分為：MTB檢出（極低，低，中，高）和未檢出。GeneXpertMTB/RIF檢測法對RIF耐藥的檢測結(jié)果分為：RIF Resistance檢出，即RIF耐藥；RIF resistance未檢出，即RIF敏感。本次對GeneXpertMTB/RIF檢出都判定為MTB檢出陽性。

1.4.4 涂片抗酸桿菌檢查

涂片經(jīng)火焰固定，加石碳酸復(fù)紅液染色5~10 min后，加酸性酒精溶液脫色1~2 min，重復(fù)操作直至紅色完全脫掉，加亞甲基藍(lán)溶液染色30 s，水洗、干燥、鏡檢。

1.5 觀察指標(biāo)

以細(xì)菌學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較不同檢測方法對結(jié)核分枝桿菌檢出的情況；敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%。

以MGIT960藥敏法為標(biāo)準(zhǔn)分析GeneXpertMTB/RIF Assay檢測法檢測RIF耐藥性的敏感性及特異性。

1.6 統(tǒng)計方法

本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X ±SD）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用X2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測方法對MTB檢出情況比較

GeneXpertMTB/RIF、MGIT960培養(yǎng)法及直接涂片法檢測痰液標(biāo)本中MTB的敏感度分別為60.14%、58.11%、24.32%，GeneXpertMTB/RIF與MGIT960培養(yǎng)法比較無差異（P>0.05），與直接涂片法比較有明顯差異（P<0.05）；特異度分別為100.00%、92.00%、94.00%，GeneXpertMTB/ RIF與MGIT960培養(yǎng)法和直接涂片法比較均有顯著差異（P<0.05），見表1。

2.2 GeneXpertMTB/RIF檢測法對RIF耐藥性測定的敏感性及特異性

148例肺結(jié)核標(biāo)本中，BACTECMIT960法檢測86例陽性，其中有79例GeneXpertMTB/ RIF也為陽性；以MGIT960藥敏法為標(biāo)準(zhǔn)，79例標(biāo)本的GeneXpertMTB/RIF檢測法檢測RIF耐藥性 的敏感度為100.00%，特異度為95.31%，見表2。

表1 不同檢測方法對MTB的檢出情況

表2 GeneXpertMTB/RIF檢測法檢測RIF耐藥性的敏感性及特異性

3 討論

利福平是治療結(jié)核病的常用藥物。但是，研究發(fā)現(xiàn)利福平在耐多藥結(jié)核中非常常見，發(fā)生頻率超過95%，因此對于肺結(jié)核來說，快速明確診斷、確定結(jié)核菌耐藥情況對結(jié)核病臨床治療意義重大[5]。

傳統(tǒng)痰涂片抗酸染色，雖然費用低，但假陰性很高，容易漏診病人，并且對病人合理用藥無法提供參考。而液體培養(yǎng)法MGIT960檢測MTB及藥物敏感性準(zhǔn)確度高，但耗時長，最快陰性報告需要一周的時間，而陽性及藥敏報告在無污染和其他因素的干擾下也需要最少兩周左右的時間[6]，不利于早期診斷。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)被用于結(jié)核病和MTB RIF耐藥性的快速檢測和診斷。該系統(tǒng)為全自動一體化半定量巢式實時聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)，主要針對MTB的81 bp利福平耐藥核心區(qū)間設(shè)定引物、探針并進(jìn)行擴(kuò)增檢測，根據(jù)其是否發(fā)生基因突變來檢測樣本中是否含有MTB及其是否對利福平耐藥，核酸提取、純化及濃縮均為全自動化處理，因此可在2 h內(nèi)獲得結(jié)果[7]。本研究通過多種方法檢測痰液標(biāo)本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GeneXpertMTB/RIF對MTB檢出的敏感性和特異性均較傳統(tǒng)檢測方法高；GeneXpertMTB/RIF檢測示MTB對利福平耐藥的敏感度為100.00%，特異度為95.31%。

可見，GeneXpertMTB/RIF 檢測法的檢測速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)，有助于實驗室結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的快速鑒定和篩查，對結(jié)核病患者的早期診斷和治療有著非常重要的價值。