王合兵，肖堅(jiān)，陳文新，楊炳林，卓德祥

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院 1.乳腺科 2.檢驗(yàn)科，福建 三明 365000）

乳腺癌是乳腺組織上皮細(xì)胞發(fā)生癌變的一種惡性腫瘤，其在婦女群體中尤為高發(fā)，尤其是40～55 歲中老年婦女，占婦女腫瘤約1/3［1］。據(jù)報(bào)道，乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不清晰，然而誘導(dǎo)其高發(fā)的危險(xiǎn)因素廣泛存在，包括遺傳、生活習(xí)慣等［2］。乳腺癌在臨床早期癥狀不明顯，且患者意識較弱，其多表現(xiàn)為乳頭凹陷、乳頭溢液等［3］。有研究指出，乳腺癌本身無致命危險(xiǎn)，但具有全身性，從早期階段開始腫瘤細(xì)胞便可通過血液或者淋巴管進(jìn)行微小轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者手術(shù)治療后體內(nèi)仍存在未檢測出殘余的腫瘤小病灶，在短暫時(shí)間內(nèi)便可復(fù)發(fā)。因此，疾病的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其危險(xiǎn)性高的關(guān)鍵［4］。

近年來乳腺癌更加高發(fā)，躍居肺癌之后，對婦女患者打擊巨大，加上人們生活質(zhì)量的提高，該疾病的及時(shí)治療受到關(guān)注［5］。降低疾病轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率的關(guān)鍵在于早期檢測出患者體內(nèi)轉(zhuǎn)移微病灶并于治療后監(jiān)控殘存的微病灶。以往臨床會根據(jù)乳腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)等指導(dǎo)治療方案，但其均建立在患者有意識地就醫(yī)基礎(chǔ)上，因此常規(guī)方法過于局限且準(zhǔn)確性偏低［6］。現(xiàn)有研究指出，通過檢測外周血中波形蛋白（Vimentin）、細(xì)胞角蛋白19（CK-19）水平來診斷乳腺癌準(zhǔn)確性更高，尤其用于早期診斷及預(yù)后［7］。本文對外周血CK-19、Vimentin 信使RNA（mRNA）在早期診斷乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用進(jìn)行研究，旨在為臨床提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年8 月至2016 年7 月福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院收治的68 例乳腺癌女性患者，根據(jù)陽性率高低分為觀察組（陽性率高）和對照組（陽性率低），每組34 例。其中，年齡22～73 歲，平均（46.53±16.25）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)［8］：①符合乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；②經(jīng)X 射線或乳腺彩超診斷；③經(jīng)組織病理學(xué)證明；④無其他惡性腫瘤引起的轉(zhuǎn)移病灶或惡性腫瘤；⑤患者及其家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)血液性、免疫性疾??；②并發(fā)嚴(yán)重的基礎(chǔ)功能性疾?。虎郯橛袊?yán)重抑郁等精神類疾病。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有研究對象入院后行外周血CK-19、Vimentin mRNA 檢測，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法檢測CK-19、Vimentin。按說明書應(yīng)用Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司）提取樣本總RNA,DNA Marker、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖、擴(kuò)增試劑盒均購于大連寶生物工程公司，所用的引物均由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成。將樣本加入1 mL Trizol 裂解，200 μL 氯仿萃取，75% 乙醇洗滌，然后開始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每管逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總量10 μL。每管中加入各種試劑固定總量為5.25 μL，再加入1 μg 總RNA 體積，用DEPC-H2O 補(bǔ)充至10 μL，混勻、離心。反應(yīng)條件：42℃預(yù)變性30 min，99℃變性5 min，4℃退火5 min，72℃延伸8 min延伸以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。生成cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共20 個(gè)循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率；②計(jì)算血清CK-19、Vimentin mRNA 單項(xiàng)檢測及兩種指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性；③用Logistic 回歸分析血清CK-19、Vimentin mRNA 診斷乳腺癌的臨床價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；多因素分析用Logistic 回歸模型，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率比較

觀察組與對照組發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分別為23 例（67.65%）、8 例（23.53%），兩組轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.339,P=0.000）。

2.2 各標(biāo)志物及聯(lián)合檢測的診斷效果指標(biāo)情況

CK-19+Vimentin 聯(lián)合檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各標(biāo)志物及聯(lián)合檢測的診斷效果指標(biāo)情況（%）

2.3 各指標(biāo)對乳腺癌診斷價(jià)值的Logistic 回歸分析

Logistic 回歸分析顯示，CK-19、Vimentin mRNA 及CK-19+Vimentin 與乳腺癌診斷有密切的相關(guān)性（P<0.05）。見表2。

表2 各指標(biāo)對乳腺癌診斷價(jià)值的Logistic 回歸分析參數(shù)

3 討論

目前，乳腺癌已成為廣受注目的高危性疾病之一，其危險(xiǎn)性主要體現(xiàn)為轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。隨著人們生活壓力的增大，吸煙、飲酒等高危因素越來越多，導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病率不斷增加，因此對乳腺癌的治療已成為臨床關(guān)注的焦點(diǎn)［10］。有研究指出，在疾病早期，腫瘤細(xì)胞便開始從原發(fā)灶脫落，經(jīng)血液循環(huán)存在于外周血、淋巴結(jié)中，其在合適的機(jī)會下侵入其他組織，導(dǎo)致疾病的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)；從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)形成的惡性細(xì)胞稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs），其容易引起腫瘤的進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［11］。因此，乳腺癌的早期診斷和術(shù)后監(jiān)測至關(guān)重要。有報(bào)道顯示，僅憑以往采用的影像技術(shù)對患者手術(shù)前后進(jìn)行檢查，檢查出微轉(zhuǎn)移灶的可能性較低，導(dǎo)致誤診率和復(fù)發(fā)率較高，且其成本較高［12］?，F(xiàn)階段隨著腫瘤治療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床逐漸意識到CTCs 作為檢驗(yàn)指標(biāo)所起的關(guān)鍵作用，其可在RT-PCR 技術(shù)的作用下進(jìn)行擴(kuò)增，達(dá)到具有敏感性和特異性的診斷價(jià)值，而CK-19 mRNA 和Vimentin mRNA 是CTCs 表達(dá)的主要因子，其用于診斷乳腺癌早期的可靠標(biāo)志物對科技、經(jīng)濟(jì)及社會的發(fā)展具有很好的推動作用［13］。

以往大量研究表明，臨床研究的CTCs 多以間質(zhì)亞型存在，其具有存活于血液循環(huán)并適時(shí)入侵其他組織器官的能力［14］。CK-19 mRNA 作為乳腺癌CTCs 的上皮型標(biāo)志物，CK 是一種骨架蛋白，其構(gòu)成了上皮細(xì)胞的骨架以保持其完整和連續(xù)；同時(shí)其也構(gòu)成了來源于上皮細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞的中間絲，決定著上皮細(xì)胞的增值分化程度。正常情況下，其在外周血中不存在CK-19 mRNA；而在病理情況下，當(dāng)機(jī)體乳腺組織的上皮腫瘤細(xì)胞侵入血液，血液中便可檢測到CK-19 mRNA，因此其可作為檢測乳腺癌早期、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的指標(biāo)。然而有研究指出，在轉(zhuǎn)移性的上皮型腫瘤中，在較多樣本中并不能檢測到CK-19 mRNA，可能是由于在以上皮型抗原為目的的實(shí)驗(yàn)過程中，另一種細(xì)胞亞群被忽視，即Vimentin［15］。多項(xiàng)研究證實(shí)，血清Vimentin mRNA 是診斷乳腺癌的特異性標(biāo)志物，其在疾病轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的監(jiān)測中價(jià)值較高［16］。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（EMT）是指病理情況下上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的過程，與癌癥的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移等進(jìn)程密切相關(guān)。EMT 發(fā)生時(shí)，可導(dǎo)致乳腺癌上皮細(xì)胞喪失其原上皮表型如Cytokeratin、Ecadherin 等，轉(zhuǎn)化為Vimentin、Fibronectin 等間質(zhì)表型，細(xì)胞骨架也由以CK 為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐訴imentin 為主。

有研究顯示，正常人生理情況下，外周血檢測不會出現(xiàn)Vimentin RNA，而原上皮表型的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)性侵入外周血中，Vimentin RNA 便可在血液中檢測出。因此，其可作為檢測乳腺癌早期的靈敏指標(biāo)，此外也可用作檢測患者術(shù)后殘留小病發(fā)灶的指標(biāo)［17］。但有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)其它上皮細(xì)胞的癌變并且癌細(xì)胞入血時(shí)，也能引起外周血Vimentin RNA 水平升高，其檢測特異性受限［18］。因此可發(fā)現(xiàn)該兩項(xiàng)指標(biāo)單項(xiàng)檢測時(shí)的敏感性和特異性均受限。大量研究證實(shí)，聯(lián)合兩項(xiàng)指標(biāo)檢測可綜合兩者的優(yōu)點(diǎn)，避免局限性，最終提高臨床診斷的準(zhǔn)確性和診斷價(jià)值［19-20］。本研究結(jié)果顯示，觀察組發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移數(shù)明顯多于對照組，表明復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者外周血CK-19、Vimentin mRNA 的陽性率高，通過比較陽性率或敏感性等方面差異，較臨床影像檢測出復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)間更早，突出乳腺癌外周血CK-19、Vimentin mRNA 的陽性率在早期診斷復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌中的應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)CK-19、Vimentin mRNA 聯(lián)合檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確性高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測，證實(shí)兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確率更高，有利于乳腺癌的早期診斷及術(shù)后恢復(fù)監(jiān)測，有利于患者預(yù)后提高。

綜上所述，血清CK-19、Vimentin mRNA 對于乳腺癌的早期診斷和轉(zhuǎn)移具有一定的價(jià)值，同時(shí)指標(biāo)的聯(lián)合檢測可增加準(zhǔn)確性，指導(dǎo)患者治療效果明顯，值得臨床推廣應(yīng)用。