季永欣，王春子，李雪，李 莉

季永欣，王春子，李雪，浙江中醫(yī)藥大學附屬湖州中醫(yī)院急診科 浙江省湖州市 313000

李莉，浙江中醫(yī)藥大學附屬湖州中醫(yī)院消化科 浙江省湖州市 313000

0 引言

胃癌是起源于胃黏膜上皮的常見消化道惡性腫瘤之一，在我國各種惡性腫瘤中發(fā)病率居首位，好發(fā)于50歲以上人群，且近年來呈年輕化趨勢.目前胃癌的診斷和治療方面存在諸多問題，由于早期胃癌多數(shù)患者無明顯癥狀，難以引起足夠重視，且胃鏡檢查早期胃癌檢出率低，因此大多數(shù)患者就診時都處于中晚期，對放化療治療敏感性較差，5年生存率明顯低于早期胃癌患者[1].胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個漸進過程，胃黏膜腸化生(gastric intestinal metaplasia，GIM)在此過程中是胃黏膜從良性向惡性轉變的重要環(huán)節(jié)，是胃黏膜在修復過程中偏離正常軌道的表現(xiàn)[2].已有研究證實GIM為腸型胃癌密切相關的癌前病變[3]，因此探討GIM發(fā)生、持續(xù)、發(fā)展過程，對于逆轉癌前病變、選擇合適的干預治療靶點具有重要意義.Krüppel樣因子5(krüppel-like factor 5，KLF5)是一種可與DNA結合的鋅指轉錄調節(jié)因子，廣泛參與胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程[4].目前已發(fā)現(xiàn)KLF5在諸多腫瘤組織中表達異常，并通過調控下游眾多靶蛋白及相關信號通路，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演者重要角色[5].Wnt信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調節(jié)作用.Wnt通路激活后細胞周期和凋亡相關基因、生長因子和粘附分子開始轉錄，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展.研究表明，在KLF5基因敲除小鼠中，Wnt通路被抑制，腸上皮內穩(wěn)態(tài)被破壞[6].既往研究發(fā)現(xiàn)一個新的、與胃癌變相關幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)毒力因子-肽酰-脯氨酰順反式異構酶，編碼蛋白為H.pyloriSlyD(HpSlyD)具有促進細胞增殖，抑制凋亡的能力.本研究通過HpSlyD誘導GIM的發(fā)生，旨在探究KLF5對GIM發(fā)生機制的影響.

1 材料和方法

1.1 材料 正常胃粘膜和腸上皮化生組織的選取:收集2015-05/2018-01在我院病理科存檔的石蠟標本，包括正常胃黏膜標本20例來自良性胃病患者，均無癌癥相關性疾病病史; 病理診斷證實為腸化生的胃黏膜標本20例，所有患者均簽署知情同意書.

HpSlyDH.pylori重組蛋白(中國醫(yī)科大學附屬腫瘤研究所腫瘤病因與篩查研究室制備); 胰蛋白酶(上?？道噬锟萍加邢薰?; RNA提取試劑盒(哈爾濱新海基因檢測有限公司); RIPA(上海吉至生化科技有限公司);蛋白酶抑制劑(上海偉寰生物科技有限公司); MTT試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司); Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(廣州威佳科技有限公司); SDS-PAGE蛋白緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司); ECL顯影液(上海士鋒生物科技有限公司); 相關抗體(英國Abcam公司).

超凈工作臺(上海輔澤商貿有限公司); 紫外分光光度計(上?？泼羯锟萍加邢薰?; 恒溫水浴鍋(南京貝登醫(yī)療股份有限公司); 倒置顯微鏡(北京佳源興業(yè)科技有限公司); 酶標儀(北京安麥格貿易有限公司); 低速離心機(上海翊圣生物科技有限公司); 電泳槽(廣州威佳科技有限公司); 轉膜儀(上海艾研生物科技有限公司); 水平搖床(武漢純度生物科技有限公司); 化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海易孛特光電技術有限公司).

1.2 方法 將細胞分為空白對照組、HpSlyD組(200 ng/mL的HpSlyD處理)、干擾對照組(200 ng/mL的HpSlyD+陰性序列)、干擾KLF5組(200 ng/mL的HpSlyD +KLF5 siRNA)、Wnt激動劑組(200 ng/mL的HpSlyD +KLF5 siRNA+氯化鋰)、Wnt激動劑+干擾KLF5組.GES1細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 μ/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況2-3 d更換培養(yǎng)液，細胞長至50%-60%密度時，將50 nmol/L濃度KLF5 siRNA和陰性序列轉染GES1細胞，24 h更換培養(yǎng)液，加入200 ng/mL的HpSlyD處理，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h，觀察細胞感染情況.

1.3 檢測方法

1.3.1 RT-PCR法檢測相關基因表達:取出GES1細胞(正常胃黏膜組織、腸化生組織)，加入Trizol試劑提取總RNA，取5 μL提取的總RNA，采用分光光度儀測定樣品光密度值，計算RNA純度和濃度.按照試劑說明配制反應體系和設定反應時間進行逆轉錄反應，按照引物說明書進行參數(shù)設置，冰上進行PCR反應體系的制備，設陰性對照組.采用2-△△CT公式分析KLF5、Wnt3a、絨毛蛋白1(Villin 1，VIL1)、三葉因子Ⅱ(trefoil factor 2，TFF2)、尾側同源盒因子2(caudal homeobox factor 2CDX2)表達量.

1.3.2 MTT法檢測各組GES1細胞增殖情況:取對數(shù)生長期的GES1細胞，接種于24孔板中，在每個孔中加入濃度為5 mg/mL MTT溶液20 μL和l80 μL的改良性RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，丟棄上清液并添加150 μL DMSO，上清液在恒溫震蕩箱中搖10 min，用酶標法測定各組492 m波長處的吸光度值.細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值).

1.3.3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況:GES1細胞接種于6孔板，次日轉染和換液，48 h后進行消化細胞并用新鮮培養(yǎng)基重懸，PBS洗滌兩次收集細胞1-5×105/mL，加Binding Buffer 500 μL，分別加入Annexin V-FITC和PI各50 μL混勻，60 min內進行流式細胞儀觀察和檢測.

表1 腸化生組織中KLF5、Wnt3a蛋白表達分析(mean±SD)

表2 干擾KLF5表達對HpSlyD誘導的GES1細胞增殖、凋亡的影響(mean±SD)

表3 干擾KLF5表達對HpSlyD誘導的GES1細胞腸化生蛋白的影響(mean±SD)

1.3.4 Western blot法檢測蛋白的表達:收集各組GES1細胞，按照BCA法測定蛋白濃度，蛋白液中滴加5×SDS上樣緩沖液，充分離心使蛋白質變性，-80 ℃保存; 制備濃縮膠和分離膠，采用恒定電壓進行電泳，1 h后電轉移至PVDF膜，常溫封閉2 h.將一抗用TBST稀釋至適當濃度加入，4 ℃孵育過夜，加入相應的二抗室溫孵育2 h，電化學發(fā)光試劑顯色、曝光.

統(tǒng)計學處理本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件包進行分析，計量數(shù)據(jù)均采用(mean±SD)表示，多個樣本數(shù)據(jù)間的比較先進行方差齊性檢驗，方差相等時采用t檢驗或方差分析，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 腸化生組織中KLF5、Wnt3a mRNA和蛋白表達分析 RT-PCR法、Western blot法檢測結果顯示，KLF5、Wnt3a mRNA和蛋白表達量在腸化生組織中明顯高于在正常胃黏膜中的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01).見表1、圖1.

2.2 干擾KLF5表達對HpSlyD誘導的GES1細胞增殖、凋亡的影響 HpSlyD組、干擾對照組細胞增殖率明顯高于空白對照組、凋亡率明顯低于空白對照組(P＜0.05)，干擾KLF5組細胞增殖率明顯低于HpSlyD組、凋亡率明顯高于HpSlyD組(P＜0.05).見表2、圖2、圖3.

2.3 干擾KLF5表達對HpSlyD誘導的GES1細胞腸化生蛋白的影響 HpSlyD組、干擾對照組細胞VIL1、TFF2、CDX2 mRNA和蛋白表達明顯高于空白對照組(P＜0.05)，干擾KLF5組細胞VIL1、TFF2、CDX2 mRNA和蛋白表達明顯低于HpSlyD組(P＜0.05).見表3、圖4.

表4 Wnt激動劑對干擾KLF5表達調節(jié)細胞中相關基因的影響(mean±SD)

圖1 Western blot法檢測KLF5、Wnt3a蛋白表達.組 KLF5:Krüppel樣因子5.

圖2 干擾KLF5表達對HpSlyD誘導的GES1細胞增殖、凋亡的影響.HpSlyD組 vs 空白對照組、干擾對照組 vs 空白對照組aP＜0.05; 干擾KLF5組 vs HpSlyD組比較bP＜0.05.

2.4 Wnt激動劑對干擾KLF5表達調節(jié)細胞中相關基因的影響 HpSlyD組、干擾對照組細胞Wnt3a、β-catenin、CDX2 mRNA表達明顯高于空白對照組(P＜0.05)，干擾KLF5組細胞Wnt3a、β-catenin、CDX2 mRNA表達明顯低于HpSlyD組(P＜0.05).而Wnt激動劑+干擾KLF5組Wnt3a、β-catenin、CDX2 mRNA表達明顯高于干擾KLF5組(P＜0.05).見表4.

3 討論

我國胃癌發(fā)病率高居常見惡性腫瘤第二位，已成為嚴重的社會公共衛(wèi)生問題.腸化生和異型增生是重要的胃黏膜癌前病變，往往首先導致胃中央凹的形態(tài)學改變，表現(xiàn)為病灶黏膜的不同程度萎縮、糜爛，腸化的發(fā)生可提高胃癌發(fā)生風險10倍以上[7]，因此探討GIM的病變機制，繼續(xù)尋找胃癌可能的早期診斷和可能的治療靶點是非常重要的.

KLF5屬于KLF家族，人源性KLF5基因位于第13號染色體長臂21區(qū)1帶，由4個外顯子、3個內含子組成.KLF5基因編碼的蛋白是一種核轉錄激活劑，細胞質翻譯完成后，其可通過核孔進入細胞核結合靶基因啟動子5'端上游的特定序列，對相關基因的表達起調節(jié)作用.KLF5在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中涉及到多種病理過程和基因的修飾[8].相關資料顯示，KLF5參與多種信號通路影響加速通過G1/S期和G2/M期來促進細胞增殖，然而也有一部分學者認為KLF5在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中起抑制增殖的作用，因為其可能降低雌激素受體對促增殖基因的激活，最終消除后者促進細胞增殖的作用[9].此外KLF5還可通過影響細胞凋亡實現(xiàn)對細胞生物學行為的調控，國外有學者通過研究發(fā)現(xiàn)，KLF5可通過激活c-Jun氨基末端激酶上游關鍵性激酶促進食管癌細胞凋亡[10].近年來有學者研究發(fā)現(xiàn)KLF5協(xié)同其他因子可促進胃癌的發(fā)生發(fā)展[11].本研究采用HpSlyD誘導胃黏膜細胞，觀察干擾KLF5表達對GIM發(fā)生的作用機制，結果顯示 KLF5、Wnt3a mRNA和蛋白表達量在腸化生組織中明顯升高，提示KLF5可能在GIM發(fā)生過程中起著重要作用.進一步研究發(fā)現(xiàn)HpSlyD可促進細胞GES1細胞增殖、并抑制凋亡，而干擾KLF5表達后可抑制HpSlyD對細胞增殖、凋亡的影響.有研究發(fā)現(xiàn)，KLF5可促進乳腺癌細胞增殖、遷移等惡性生物學行為，并促進癌癥的發(fā)展，與本研究結果一致[12].

圖3 各組細胞GES1細胞凋亡情況.

圖4 Western blot法檢測VIL1、TFF2、CDX2蛋白表達.VIL1:絨毛蛋白1、TFF2:三葉因子Ⅱ、CDX2尾側同源盒因子2.

VIL1是一種重要的細胞支架蛋白，可使肌動蛋白成束聚集在微絨毛組成結構上，在腸化生組織中可以檢測到VIL1表達上調，其在炎性疾病和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生了質和量的改變[13].有研究發(fā)現(xiàn)VIL1為CDX2轉錄調控的靶基因，CDX2可直接促進多種腸細胞特異因子轉錄表達，兩者在GIM發(fā)生過程中發(fā)揮著非常關鍵的作用.TFF主要功能為保護黏膜并促進修復.VIL1、CDX2、TFF為腸上皮化生的標志蛋白[14].本研究結果顯示，干擾KLF5表達可抑制HpSlyD對VIL1、TFF2、CDX2 mRNA和蛋白的上調作用.越來越多的研究表明Wnt信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，Wnt蛋白為細胞分泌的一類的蛋白質，過度表達可產生致癌作用[15，16].本研究結果顯示，Wnt激動劑干預后，干擾KLF5 表達對Wnt3a、β-catenin、CDX2 mRNA的影響被抑制，提示KLF5 可能通過Wnt/β-catenin通路促進HpSlyD誘導的腸上皮化生.

4 結論

綜上所述，干擾KLF5表達可顯著抑制HpSlyD誘導的胃黏膜化生的發(fā)生，KLF5可能通過激活Wnt/β-Catenin促進HpSlyD誘導的胃黏膜化生，為胃癌的臨床預防提供了新的靶點.

文章亮點

實驗背景

Krüppel樣因子5(krüppel-like factor 5，KLF5)基因在多種腫瘤組織中表達水平上調，發(fā)揮促癌基因的作用，但其在胃癌中作用機制目前尚不十分清楚.研究表明，沉默干擾KLF5可以通過調節(jié)Wnt/β-catenin通路抑制結腸癌細胞的生長、遷移和侵襲，但KLF5是否調節(jié)Wntβ-catenin通路影響胃黏膜腸化生細胞生物學特性尚不清楚.

實驗動機

本研究擬明確KLF5基因是否通過調節(jié)Wntβ-catenin通路促進胃黏膜腸化生細胞增殖、抑制細胞凋亡，旨在闡明KLF5基因在胃癌及胃黏膜化生的作用機制.

實驗目標

本研究結果顯示沉默干擾KLF5基因可抑制GES1細胞增殖，促進細胞凋亡，進一步明確了KLF5基因的功能，為動物實驗、臨床實驗提供了基礎.

實驗方法

體外培養(yǎng)胃黏膜上皮細胞GES1，構建沉默干擾KLF5的GES1細胞，采用MTT法、流式細胞儀分別檢測沉默干擾KLF對細胞增殖、凋亡情況，采用RT-PCR法檢測腸化生和Wnt β-catenin通路相關基因的表達.Western blot法檢測腸化生相關蛋白的表達.

實驗結果

KLF5在胃黏膜腸化生組織中表達上調，沉默干擾KLF5可抑制GES1細胞增殖，并促進細胞凋亡，抑制腸化生相關基因和蛋白的表達，Wnt激動劑干預后，沉默干擾KLF5表達Wnt β-catenin通路相關基因表達的影響被抑制.

實驗結論

沉默干擾KLF5可抑制Wnt β-catenin通路，抑制胃黏膜上皮細胞GES1增殖，并促進細胞凋亡.

展望前景

本研究僅初步證實KLF5在胃黏膜腸化生的作用可能與調節(jié)Wnt β-catenin通路有關，在未來的研究中，我們將繼續(xù)探索KLF5與Wnt β-catenin通路特異性結合的相關分子靶向，并通過免疫組化等技術進一步提高說服力.