譚 超 鄒黎黎

(1. 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學(xué))， 湖北 宜昌 443002； 2. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 輸血科， 湖北 宜昌 443003)

多重耐藥菌(multidrug-resistant organism，MDRO)主要是指對臨床使用的三類或三類以上抗菌藥物同時呈現(xiàn)耐藥的細(xì)菌[1]。在臨床上常引起呼吸道、血液、尿路以及傷口等部位的感染，呈現(xiàn)復(fù)雜性、難治性等特點。其治療難度在逐步加大、導(dǎo)致感染的病死率逐漸增高、臨床病程及治療費(fèi)用也在延長和增加，是醫(yī)院需要防控的重要病原菌[2]。金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus, SA)是臨床上常見的醫(yī)院感染菌，自1961年發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金葡菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)以來，多種多重耐藥菌株不斷被發(fā)現(xiàn)，其導(dǎo)致的多重耐藥感染逐漸成為臨床診治的難點[3]。因此，研發(fā)新的抗生素作用靶點，特別是無法產(chǎn)生耐藥性的靶點，對緩解日益嚴(yán)重的耐藥性細(xì)菌感染具有重要臨床意義。

依布硒啉(2-苯基-1,2-苯丙異硒唑-3(2H)-酮，Ebselen)，最早作為一種含硒的脂溶性有機(jī)小分子化合物合成于德國[4]。它是第一個被報道的具有谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)類似物活性的有機(jī)硒化合物分子[5]。因其體內(nèi)外的抗氧化、抗炎特性在1997被日本Daiichi制藥公司作為中風(fēng)治療藥物用于III期臨床實驗，并在免疫系統(tǒng)功能紊亂、抗炎、抗動脈粥樣硬化、治療腦缺血等方面均表現(xiàn)出良好的治療效應(yīng)[4,5]。Ebselen可在多種感染過程中下調(diào)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，同時對病原菌造成氧化損傷，發(fā)揮抗炎殺菌活性，是一種理想的抗生素候選物。

基于此，本研究從臨床分離了108株多重耐藥性金黃色葡萄球菌，對其耐藥情況進(jìn)行分析，并探討Ebselen的殺菌效果及作用位點，以期為公共衛(wèi)生及藥理學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)科研工作者提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

收集2019年1月～2019年12月我院住院患者送檢的各類臨床細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本，分離、純化并剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌。進(jìn)一步通過凝固酶試驗，梅里埃Vitek2 Compact全自動微生物分析儀和梅里埃Vitek MS質(zhì)譜儀鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株。再采用OXOID公司生產(chǎn)的頭孢西丁等12種藥敏K-B紙片擴(kuò)散法，藥敏結(jié)果按2017年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)判斷[6]，判定108株金黃色葡萄球菌為多重耐藥菌。同時，選取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923(Microbiologics，美國)作為對照。

1.2 材料

Ebselen(TargetMol，美國)，BCA試劑盒(碧云天)，硫氧還蛋白(Cayman，美國)，乙二胺四乙酸(EDTA)(上海滬試)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)(Roche Diagnostics，瑞士)，5’, 5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)(Sigma，美國)，LB培養(yǎng)基(Thermo，美國)，96孔板(Corning，美國)，Vitek2 Compact全自動微生物分析儀(法國)，梅里埃革蘭陽性菌生化鑒定卡(法國)，梅里埃Vitek MS質(zhì)譜儀(法國)，全波長Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(Thermo，美國)。

1.3 微孔法合并涂板計數(shù)法觀察Ebselen對金黃色葡萄球菌生長的情況

將臨床分離鑒定，并進(jìn)行藥敏實驗后的菌株置于LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)4～6 h，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用全波長Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀調(diào)整OD600 nm=0.4，再用LB培養(yǎng)基將調(diào)整后的菌液1∶100稀釋后用于下游實驗。

于96孔板的微孔中加入100 μL菌液，再加入100 μL濃度梯度Ebselen(0，2.5，5，10，20，40 μM)，混勻后置于37℃培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)16 h后通過全波長Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀測定細(xì)菌的生長情況。

1.4 DTNB實驗測定Ebselen對金黃色葡萄球菌硫氧還蛋白還原酶活性的影響

將生長過夜的菌液轉(zhuǎn)接至新LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用全波長Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀調(diào)整OD600 nm=0.4。在15 mL搖菌管中加入5 mL菌液，再加入80 μM Ebselen，混勻后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min。于4℃、10 000 rpm離心5 min收集菌體，PBS洗滌3次，重懸于 50 mM Tris-EDTA(pH 7.4)緩沖液中。將收集獲得的菌體超聲波破碎(240 W，10 s，間隔3 s，共計5 min)后，4℃、12 000 rpm離心20 min收集上清液，通過Bradford試劑盒測定蛋白濃度。在96孔板中加入25 μg細(xì)菌蛋白，加入2 mM EDTA和200 μM NADPH于37℃ 孵育5 min。隨后加入5 μM 硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)和2 mM DTNB進(jìn)行孵育，于412 nm 處測定5 min連續(xù)吸光值，計算斜率以代表細(xì)菌硫氧還蛋白還原酶(bacterial thioredoxin reductase, TrxR)活性(未處理組的TrxR活性計為100%)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，MIC兩兩比較采用Student’st-test檢驗，TrxR百分?jǐn)?shù)兩兩比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床108株多重耐藥金黃色葡萄球菌的耐藥情況分析

根據(jù)藥敏結(jié)果數(shù)據(jù)整理，本次收集到的108株金黃色葡萄球菌全部為多重耐藥菌，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的比例高達(dá)78.70%(見表1)。

2.2 Ebselen對108株臨床多重耐藥金黃色葡萄球菌的殺菌效果

使用微孔和涂布法檢測Ebselen對臨床分離得到的多重耐藥金黃色葡萄球菌菌株的殺菌效果。如表2所示，Ebselen對本次分離得到的108株耐藥菌株(編號001～108)均表現(xiàn)出理想的殺菌效應(yīng)。其中，對編號010為代表的菌株最敏感，使用濃度為5 μM，與MIC為2.5 μM的標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.005)；對編號094為代表的菌株最不敏感，使用濃度為40 μM，與標(biāo)準(zhǔn)株相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.000 1)。

表1 108株臨床金黃色葡萄球菌的耐藥率分析

表2 Ebselen對108株臨床多重耐藥金黃色葡萄球菌菌株的MIC

表3 Ebselen對108株臨床多重耐藥金黃色葡萄球菌TrxR活性的影響

2.3 Ebselen對108株臨床多重耐藥金黃色葡萄球菌TrxR活性的影響

使用DTNB法檢測Ebselen對108株臨床多重耐藥金黃色葡萄球菌TrxR活性的影響。如表3所示，Ebselen可靶向抑制本次分離得到的108株耐藥菌TrxR的活性。實驗將未加入Trx蛋白組的吸光值作為背景，用未加入Ebselen組(對照組)的吸光值扣除背景后得到的值記為TrxR活性并設(shè)置為100%。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步計算Ebselen處理后的各多重耐藥金黃色葡萄球菌的TrxR活性。結(jié)果顯示，Ebselen處理組的TrxR活性為8.3%～51.9%，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.000 1)。

3 討論

金黃色葡萄球菌是社區(qū)獲得性感染的常見病原菌，可產(chǎn)生多種毒素，在臨床上具有很強(qiáng)的致病能力[7]。而隨著廣譜抗菌藥物的大量使用，金黃色葡萄球菌對多種抗菌藥物呈現(xiàn)耐藥性，極大地限制臨床用藥的選擇，增加了臨床患者的病死率和疾病負(fù)擔(dān)[8]。

Trx是廣泛存在于生物體內(nèi)，高度保守的氫載體小分子蛋白，相對分子質(zhì)量約為12 kDa，在細(xì)胞中以氧化態(tài)和還原態(tài)的形式存在，是絕大多數(shù)革蘭陽性細(xì)菌(谷胱甘肽系統(tǒng)缺失細(xì)菌，GSH-negative bacteria)合成DNA及RNA的唯一供電子和抗氧化關(guān)鍵系統(tǒng)[9,10]。哺乳動物TrxR是一種以頭對尾方式排列的二聚體酶，含有兩個相對分子質(zhì)量為55 kDa的亞基，分為胞質(zhì)TrxR1、線粒體TrxR2、睪丸特異性TrxR3等3種形式；而細(xì)菌TrxR的兩個亞基相對分子量僅為35 kDa，缺少界域面[11,12]。兩者在分子量，結(jié)構(gòu)上的天然差異，使得細(xì)菌的TrxR成為某些抗生素發(fā)揮差異性毒力的作用靶標(biāo)。值得注意的是，在生理情況下，氧化態(tài)的Trx(oxidized Trx)可被TrxR還原為還原態(tài)Trx(reduced Trx)[13]。而Ebselen是一種人工合成，具有廣泛生理藥理活性的脂溶性含硒有機(jī)小分子化合物，對耐藥性金黃色葡萄球菌的殺傷作用主要依賴于其靶向作用于Trx活性位點的二硫醇Cys135-Cys138，有效阻斷電子從NADPH傳遞至Trx，造成細(xì)菌胞內(nèi)高氧化態(tài)，誘導(dǎo)和加速細(xì)菌死亡[14,15]。

本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，Ebselen可作為哺乳動物TrxR的底物，顯著提高TrxR還原活性氧(reactive oxygen species, ROS)的能力[16]。同時，Ebselen又可作為競爭性抑制劑，阻斷細(xì)菌TrxR電子傳遞能力，妨礙其還原能力的發(fā)揮，從而升高胞內(nèi)ROS，達(dá)到殺菌目的[16]。Dong等[17]在大鼠模型中評估了Ebselen對葡萄球菌性皮膚感染的局部治療效果，發(fā)現(xiàn)Ebselen可顯著降低金黃色葡萄球菌皮損的細(xì)菌負(fù)荷和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6，IL-6)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的表達(dá)，且與對照組相比，Ebselen治療組的傷口愈合和病理改變均有明顯改善。Thangamani等[18]的研究也證實，Ebselen對臨床分離的耐多藥金黃色葡萄球菌顯示了強(qiáng)大的殺菌活性，包括耐甲氧西林和萬古霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA和VRSA)，通過抑制MRSA中蛋白質(zhì)的合成進(jìn)而抑制毒素的產(chǎn)生和體外生物膜的形成。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，收集了我院108株耐多藥金黃色葡萄球菌。使用微孔和涂布法證實了Ebselen對臨床分離得到的多重耐藥金黃色葡萄球菌菌株的MIC為5～40 μM，具有良好的抗菌活性。并進(jìn)一步使用DTNB試驗證實了Ebselen是通過降低細(xì)菌胞內(nèi)TrxR的活性，實現(xiàn)對耐藥性金黃色葡萄球菌的殺傷作用。鑒于Ebselen目前已作為治療中風(fēng)的藥物進(jìn)入III期臨床試驗，具有較好的人體耐受性與較低的毒性[19]。開發(fā)其在殺菌方面的效用，屬于“老藥新用”，極大地降低了研發(fā)成本，可能是一種較為理想的潛在抗菌藥物。