孟云超，張啟芳，彭家茵，周靜霧，鄧小麗

Colon cancer; Non-tumor mucosal tissue adjacent to the tumor; Docking protein 3(DOK3); Protein tyrosine kinase 7(PTK7)

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球范圍其發(fā)病率已位居所有惡性腫瘤的第3位[1]。晚期結腸癌預后差、病死率高，而早期結腸癌可無任何臨床癥狀，診出率低。結腸腺瘤是結腸癌的癌前病變，從分子水平研究癌前病變對診斷早期結腸癌具有重要的意義[2，3]。對接蛋白3(docking protein 3,DOK3)為抑癌因子，與多種癌癥的發(fā)生具有關聯(lián)性[4]。蛋白酪氨酸激酶7(protein tyrosine kinase 7,PTK7)在許多惡性腫瘤中呈高表達[5]。但目前同時研究DOK3與PTK7在結腸癌前病變中的相關研究仍較少，鑒此，本研究通過收集結腸腺瘤伴低級別異型增生(low-grade dysplasia,LGD)、結腸腺瘤伴高級別異型增生(high-grade dysplasia,HGD)、結腸癌及瘤旁非腫瘤黏膜組織，應用免疫組化法檢測其DOK3和PTK7的表達情況，探討其在結腸癌前病變發(fā)展過程中的意義。

1 資料與方法

1.1標本來源 收集2015-01～2018-12廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院經(jīng)病理科確診的結腸腺瘤標本45例，其中LGD 22例，HGD 23例；收集結腸癌標本22例；收集瘤旁非腫瘤黏膜組織20例。結腸腺瘤標本經(jīng)結腸鏡下高頻電切除獲得；瘤旁非腫瘤黏膜組織和結腸癌組織經(jīng)活檢鉗鉗取獲得。所有患者術前均未接受過與腺瘤、結腸癌相關的治療，對此次研究治療操作知情同意。

1.2主要試劑及儀器 兔抗人PTK7抗體(美國Abcam公司)，兔抗人DOK3抗體(美國abcam公司)；山羊抗兔IgG/辣根酶標記(中杉金橋)；免疫顯色試劑(廣州安必平醫(yī)藥科技公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；攤片烤片機(湖北歐美萊醫(yī)療科技公司)；電熱恒溫水箱(嘉慶中新醫(yī)療儀器公司)；電泳儀(美國伯樂)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；H1干式恒溫儀(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；實時熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾)；超微量紫外分光光度計(美國賽默飛世爾)。

1.3免疫組織化學染色及結果評判 標本經(jīng)4%甲醛固定常規(guī)脫水、石蠟包埋，3 μm切片，常規(guī)HE染色。置于0.01 M檸檬酸鹽抗原修復液(pH=6.0)加熱煮沸修復。滴加少量3%過氧化氫于37 ℃恒溫箱孵育，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗后擦干玻片，滴加適量抗體(DOK3抗體濃度為1∶100，PTK7抗體濃度為1∶50)，于37 ℃恒溫箱孵育1 h，擦干玻片后分別滴加適量二抗，于37 ℃恒溫箱孵育30 min后以DAB溶液顯色，蘇木素染液復染，飽和碳酸鋰溶液返藍，梯度乙醇脫水，干燥，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。評判標準[6]：DOK3、PTK7在胞漿和胞膜處表達，以出現(xiàn)淺黃至深棕色為陽性。根據(jù)陽性細胞的染色強度(SI)和染色陽性細胞百分數(shù)(PP)進行計分。SI:0分，未染色或弱染色；1分，中度染色；2分，強染色。PP:0分，<5%；1分，5%～50%；2分，>50%。根據(jù)SI與PP之和確定蛋白表達水平：0～2分為低表達；3～4分為高表達。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1不同類型組織DOK3表達情況比較 DOK3主要表達于腺上皮的胞漿和胞膜。四種不同類型組織的DOK3表達情況差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。瘤旁非腫瘤黏膜和LGD組織的DOK3高表達率均顯著高于HGD和結腸癌組織(P<0.05)；HGD組織的DOK3高表達率也顯著高于結腸癌組織(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 不同類型組織DOK3表達情況比較[n(%)]

圖1 四種不同類型組織DOK3表達情況(免疫組織化學染色，×400)

2.2不同類型組織PTK7表達情況比較 PTK7主要表達于腺上皮的胞漿和胞膜。四種不同類型組織的PTK7表達情況差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結腸癌和HGD組織的PTK7高表達率均顯著高于瘤旁非腫瘤黏膜和LGD組織(P<0.05)；結腸癌組織的PTK7高表達率也顯著高于HGD組織(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 不同類型組織PTK7表達情況比較[n(%)]

圖2 四種不同類型組織PTK7表達情況(免疫組織化學染色，×400)

3 討論

3.1結腸腺瘤是結腸癌的癌前病變，其主要通過結腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)并在結腸鏡下切除[7]，其發(fā)展至結腸癌過程中可出現(xiàn)LGD和HGD。我國早期結腸癌的診出率仍較低，這與其早期臨床癥狀不顯著及對該病的發(fā)生機制尚不十分清楚有關，從分子水平研究癌前病變對診斷早期結腸癌具有重要意義。

3.2DOK3是調節(jié)酪氨酸激酶信號反饋回路的接頭蛋白，其在免疫應答中的作用尚未完全闡明[8]。DOK3對多種腫瘤的發(fā)生起抑制作用，Berger等[9]研究發(fā)現(xiàn)，DOK3通過維持程序性細胞死亡配體1和上調死亡配體2在漿細胞分化中發(fā)揮重要作用，敲除DOK3的小鼠肺腺癌的風險顯著增加，這也驗證了DOK3是一抑癌基因，具有成為肺部腫瘤治療靶點的潛力。崔建芳[4]研究發(fā)現(xiàn)，DOK3表達下降可能是胃癌變早期重要的生物學事件，其可能參與了癌前病變發(fā)展為癌變的過程，具有一定分子生物學診斷價值；且經(jīng)敲降DOK3基因后，HGC-27胃癌細胞的增殖及侵襲遷移能力顯著增強，考慮DOK3可能為一抑癌因子。然而，近期有研究[10]發(fā)現(xiàn)，DOK3的表達水平與神經(jīng)膠質瘤的惡性程度呈正相關，因此，DOK3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用仍需要進一步研究。

3.3PTK7也稱為結腸癌激酶4，參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并在多種類型的腫瘤中呈高表達[11]。有研究[12,13]表明，PTK7高表達可促進大腸癌的進展并降低患者生存率，且PTK7的致癌作用受到miR-205-5p的調節(jié)。在Ⅰ～Ⅳ期的肝細胞癌中，PTK7的表達量增加，是降低患者總生存期的危險因素，其有望成為診斷肝細胞癌和預測患者生存預后的生物標志物[14]。另有研究[6]發(fā)現(xiàn)，PTK7在前列腺癌組織中高表達，且是影響前列腺癌患者生存預后的危險因素。張東海等[15]發(fā)現(xiàn)，在結腸腺瘤組織中，PTK7在HGD組織中的表達水平高于LGD組織，且患者與性別、年齡存在關聯(lián)性。

3.4本研究發(fā)現(xiàn)，DOK3在HGD和結腸癌組織中主要呈低表達，其表達水平顯著低于LGD和瘤旁非腫瘤黏膜組織，提示DOK3可能也是結腸癌的抑癌因子，參與了結腸癌的發(fā)生、發(fā)展。與DOK3的表達情況相反，PTK7在HGD和結腸癌組織中主要呈高表達，其表達水平顯著高于LGD和瘤旁非腫瘤黏膜組織，因此推測DOK3、PTK7均參與了結腸癌前病變發(fā)展至結腸癌的過程，聯(lián)合檢測DOK3、PTK7可能具有結腸癌早期診斷以及預后判斷的價值，也可能成為結腸癌治療的潛在靶點。

綜上所述，結腸腺瘤級別越高，DOK3表達量越低，而PTK7表達量則越高。DOK3可能作為抑癌因子，PTK7作為促癌因子參與了結腸癌的發(fā)生、發(fā)展。聯(lián)合檢測DOK3、PTK7具有結腸癌早期診斷及預后判斷的應用價值。