代英杰

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中(large artery atherosclerotic stroke，LAAS)是由于顱內(nèi)外大血管的動(dòng)脈粥樣造成的缺血性腦卒中[1-3]。有研究表明，miRNAs作為一類非編碼小分子RNA，參與諸多生命活動(dòng)的調(diào)控，已成為某些疾病診斷、治療與預(yù)后判定的分子靶點(diǎn)，其在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-6]。miR-25與miRs-93、miRs-106b共同組成 miR-106-25基因簇[7]。有研究表明，miR-25在缺血性卒中患者外周血中表達(dá)水平出現(xiàn)了下調(diào)或上調(diào)[8-9]，但其在缺血性腦卒中的作用機(jī)制未見報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)LAAS患者血液中miR-25的表達(dá)水平，探討其作為該病診斷分子標(biāo)志物的可能性，同時(shí)探索miR-25在LAAS形成中的分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 將北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2015年6—12月收治的41例發(fā)病72 h內(nèi)確診LAAS患者納入B組。納入標(biāo)準(zhǔn)：有急性、突發(fā)的持續(xù)24 h以上的局灶性神經(jīng)功能缺失；經(jīng)頭顱核磁共振CT檢查發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的陽(yáng)性病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重心臟疾病，近期發(fā)生心絞痛、急性心肌梗死者；嚴(yán)重肝腎功能不全者；兩周內(nèi)服用過(guò)抗凝或抗血小板藥物者。另將同期于我院體檢的42例健康志愿者納入A組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 獲取血液標(biāo)本 通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查、體格檢查與實(shí)驗(yàn)室檢查等，收集兩組研究對(duì)象的臨床資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血壓、血脂、既往史等。B組患者分別于入院次日清晨與發(fā)病第10天進(jìn)行采血，A組于體檢當(dāng)日采集外周靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸抗凝，上下顛倒混勻后立即置于4℃冰箱保存，于2 h內(nèi)進(jìn)行血漿分離。以1 500 r/min離心10 min，將血漿轉(zhuǎn)移至1.5 ml無(wú)RNA酶離心管中，于-80℃凍存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECS)于含有10%胎牛血清的1 640培養(yǎng)基，以37℃條件下，5%CO2孵箱中培育。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，用0.25%胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d鋪6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105～4×105個(gè)/ml。待細(xì)胞密度為60%～80%時(shí)，進(jìn)行相關(guān)小RNAs、siRNA轉(zhuǎn)染。小RNAs序列如下：miR-25 模擬物(miR-25 mimics)，5′-AUUGCCCAAGUCUCCGCCUUU-3′；miR-25抑制物(miR-25 inhibitor)，5′-CAAUUGCCCAAGUCUCCGCCU-3′；陰性對(duì)照(NC)，5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′；siCYP17A1，5′-AUGAUAACUUCUGUGCCCUdTdT-3′。將小RNAs及轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME分別混于jetPRIME緩沖物，靜置10 min后滴入6孔板，置培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染后4 h，PBS漂洗，加入新鮮的培養(yǎng)基。48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) 細(xì)胞及血液總RNA提取采用TRIzol法。使用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit(Transgene公司)進(jìn)行miRNA cDNA合成。使用PrimeScript RT Master Mix Kit(Takara公司)試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA。應(yīng)用SYBR Green Real-time PCR試劑盒(TakaRa公司)擴(kuò)增miR-25與CYP17A1 cDNA。具體操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測(cè) 將消化轉(zhuǎn)染后細(xì)胞密度調(diào)整為2×104～5×104個(gè)/ml。每孔加入100 ml細(xì)胞懸液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于24、48、72、96 h，每孔加入10 ml細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。測(cè)定A450 nm波長(zhǎng)吸光度，以波長(zhǎng)吸光度作為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將消化轉(zhuǎn)染后細(xì)胞密度調(diào)整為3×104～5×104個(gè)/ml。每孔加入100 ml細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱孵育3～4 d。以PBS溶液漂洗，10%甲醛固定20 min。蘇木素染色10 min，自來(lái)水沖洗，空氣干燥，計(jì)算集落形成情況。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 消化轉(zhuǎn)染后細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105～1×106個(gè)/ml。取1 ml細(xì)胞懸液，以4℃、3 000 r/min離心10 min，棄上層清液。加入1 ml冷PBS溶液，輕震懸浮細(xì)胞。以4℃、3 000 r/min離心10 min，棄上層清液。采用100 ml binding buffer重懸細(xì)胞。收集細(xì)胞并用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。

1.2.7 Transwell小室法與劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 消化轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用雙無(wú)培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液，分別向Transwell上室加入100 μl含有2×105個(gè)HUVECS細(xì)胞，下室加入500 μl完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，取出小室，10%甲醛固定30 min，依次進(jìn)行蘇木素、伊紅染色、蘇木素復(fù)染，并用棉簽擦凈膜上表面細(xì)胞。用刀片小心剝下膜，中性樹脂封片。干燥后，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。將轉(zhuǎn)染后的HUVECS細(xì)胞接種6孔板中，用1 ml槍頭小心在孔底劃痕，PBS溶液清洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下拍照，沿劃痕邊緣等間距取3處測(cè)量劃痕寬度，取平均值。48 h后繼續(xù)拍照，在相同觀察點(diǎn)測(cè)量劃痕寬度。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象一般資料比較 B組收縮壓、低密度脂蛋白、高血壓病史比例均高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者其他一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組研究對(duì)象一般資料比較

2.2 兩組研究對(duì)象miR-25表達(dá)量比較 與治療前比較，B組治療后的miR-25表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后，B組的miR-25表達(dá)量仍顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-25表達(dá)水平與收縮壓呈正相關(guān)(r=0.37，P<0.05)。

2.3 miR-25對(duì)HUVECS細(xì)胞生物學(xué)功能的影響 與對(duì)照組相比，miR-25 mimics或miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組miR-25表達(dá)水平分別顯著升高或降低(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-25 mimics轉(zhuǎn)染組HUVECS增殖能力較對(duì)照組顯著下降，miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組HUVECS的增殖能力較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-25 mimics轉(zhuǎn)染組HUVECS克隆形成能力較對(duì)照組顯著下降，miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組HUVECS的克隆形成能力較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡結(jié)果顯示，miR-25 mimics轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組HUVECS早期凋亡率顯著升高，而miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組HUVECS早期凋亡率顯著下降(P<0.05)。Transwell小室法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染組HUVECS遷移能力顯著增加，而miR-25 mimics轉(zhuǎn)染組HUVECS遷移能力顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-25對(duì)HUVECS細(xì)胞生物學(xué)功能的影響(a.miR-25 mimics與miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)；b.細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法檢測(cè)miR-25對(duì)HUVECS細(xì)胞增殖能力的影響；c.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-25對(duì)HUVECS細(xì)胞克隆形成能力的影響；d.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-25對(duì)HUVECS細(xì)胞早期凋亡的影響；e.Transwell小室法檢測(cè)miR-25對(duì)HUVECS細(xì)胞遷移能力的影響)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化受到環(huán)境因素與遺傳因素共同影響[10]，作為一種動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病，可推測(cè)LAAS發(fā)病為多因素共同參與。近年來(lái)，諸多miRNA被報(bào)道參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[11-13]。有研究表明，miR-25的靶基因參與細(xì)胞增生、分化、遷移、凋亡炎癥、應(yīng)激等多種生物活動(dòng)的調(diào)節(jié)，在急性心肌梗死的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[14]。

本研究通過(guò)檢測(cè)LAAS患者中miR-25的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：治療后，B組miR-25表達(dá)量顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后，B組miR-25表達(dá)量顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。臨床治療可以降低LAAS患者的miR-25水平，miR-25參與LAAS的發(fā)生、發(fā)展，可能為L(zhǎng)AAS治療的潛在生物標(biāo)志物。盡管miR-25與高血壓間的關(guān)系尚未被報(bào)道，但本研究發(fā)現(xiàn)，高miR-25水平與收縮壓有關(guān)。miR-25可能在高血壓源性LAAS發(fā)病中起到重要作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-25抑制HUVECS的增殖和遷移，并促進(jìn)其凋亡。但miR-25是如何對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用的，尚需要進(jìn)一步闡明。可通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-25的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)、篩查與鑒定，并結(jié)合生物學(xué)功能研究，進(jìn)一步明確miR-25在LAAS中相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

綜上所述，miR-25可調(diào)控HUVECS增殖、遷移及早期凋亡，可能為L(zhǎng)AAS治療的潛在靶點(diǎn)。