林 清， 王永軍， 王晶鈺， 昝林森， 王繼儒， 羅順平， 王 菁， 馬國鋒， 蔡永紅

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏西海固高端牛產(chǎn)業(yè)研究院，寧夏 海原 755220；3.海原華潤農(nóng)業(yè)有限公司，寧夏 海原 755220)

2019年10—11月份,寧夏自治區(qū)中衛(wèi)市某牛場(chǎng)的安格斯?fàn)倥０l(fā)生了較為嚴(yán)重的腹瀉癥狀。死亡率高達(dá)28%。犢牛腹瀉是新生犢牛發(fā)生的一種急性腹瀉病，引起犢牛腹瀉的病因很多,包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原微生物以及營養(yǎng)因素和環(huán)境因素等[1]。犢牛出生3周左右最容易發(fā)病[2]，但本次犢牛腹瀉在產(chǎn)后3 d就出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。為有效應(yīng)對(duì)犢牛腹瀉,需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷,病原學(xué)診斷,提升準(zhǔn)確性,降低犢牛死亡率[3]。為快速查明本次安格斯?fàn)倥８篂a的原因，本文分別對(duì)發(fā)病死亡牛及時(shí)采樣送檢，進(jìn)行病原分離、鑒定、藥敏試驗(yàn)，并提出實(shí)際預(yù)防和治療措施，以指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 牛 病牛來源于寧夏自治區(qū)中衛(wèi)市某牛場(chǎng)，發(fā)病死亡牛6頭，分別采集死亡1 h后的犢牛病變心臟、肺、肝及腸系膜淋巴結(jié)組織樣，冰袋保存。

1.1.2 生化試劑 肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[4]配制，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８锾m氏染色液來自實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)(0066)，上海鴻都電子科技有限公司；自動(dòng)恒溫震蕩培養(yǎng)箱(ZH-WY-2102C)，上海智誠分析儀器制造有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GH-600BC)，北京永光明醫(yī)療器廠；4 ℃冰箱(BCD-209S/D)，海信容聲冰箱有限公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(XFH-30CA)，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)(H3-18KR)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；顯微鏡及實(shí)驗(yàn)室常用大小試管及培養(yǎng)皿等。

1.1.4 藥敏試驗(yàn) 大觀霉素(10 μg/片)，慶大霉素(10 μg/片)，青霉素(10 μg/片)，頭孢曲松(10 μg/片)，氨芐西林(10 μg/片)，以上藥敏紙片來自杭州天和微生物實(shí)際有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病理觀察 對(duì)發(fā)病犢牛癥狀、發(fā)病時(shí)間、發(fā)病特點(diǎn)、治療效果進(jìn)行診斷、處理和觀察；對(duì)死亡犢牛在1 h內(nèi)剖檢，觀察病變部位特征，并采集組織樣。

1.2.2 組織樣處理 取組織樣100 mg研磨5 min，加生理鹽水10 mL，離心10 min，取上清液涂片。

1.2.3 染色鏡檢 涂片革蘭氏染色，鏡檢觀察細(xì)菌染色及形態(tài)特征。

1.2.4 分離培養(yǎng) 將處理的組織樣取上清液100 μL搖勻，接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h后鏡檢，并將培養(yǎng)的細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后再繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)18～24 h，隨后選擇單個(gè)典型菌落染色鏡檢。

1.2.5 生化鑒定 參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6-8]方法進(jìn)行，采用K-B紙片擴(kuò)散法。

綜合上述信息之后提出預(yù)防和治療措施。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理觀察結(jié)果與分析

病例1：安格斯母犢HJ0348出生于2019年10月18日，妊娠天數(shù)261 d，體重29 kg。該犢牛于2019年10月28日開始出現(xiàn)拉稀癥狀，肌注加口服治療后，于2019年11月1日出現(xiàn)食欲不振，脫水癥狀，體溫36.8 ℃。靜注頭孢后，于2019年11月2日晚，治療無效死亡。解剖發(fā)現(xiàn)：心臟基底部有明顯的炎癥斑點(diǎn)。死亡原因：心肌炎。具體結(jié)果以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)。

病例2：安格斯母犢HJ0350出生于2019年10月19日，妊娠天數(shù)278 d，體重27 kg。該犢牛于2019年10月27日開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，肌注加口服治療后，2019年10月31日出現(xiàn)精神不振，不食癥狀，體溫：35.8 ℃。靜注頭孢治療后于2019年11月3日無效死亡。解剖發(fā)現(xiàn)：腸系膜發(fā)炎，腸管發(fā)炎，心臟基底部有果凍樣病變，肺臟蒼白。死亡原因：腸炎繼發(fā)心肌炎死亡。

以上發(fā)病均在產(chǎn)后10 d左右，與一般報(bào)道在3周內(nèi)發(fā)病情況類似，但有提早發(fā)病的趨勢(shì)。詳情見圖1～3。

圖1 心肌病變圖片

圖2 肺組織病變圖片

圖3 腸系膜病變圖片

2.2 病原分離培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同組織的樣品進(jìn)行了處理，通過病原菌分離、培養(yǎng)、鑒定等過程，得出病原菌為志賀氏桿菌導(dǎo)致的犢牛腹瀉病的結(jié)論，詳見圖4～6(未注明的是肺組織培養(yǎng)群落)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表1。

圖4 肺部組織病原鑒定

圖5 心臟組織病原鑒定

圖6 不同組織病原菌培養(yǎng)群落

表1 犢牛腹瀉病原的藥敏試驗(yàn)

資料顯示：志賀氏桿菌大小為(0.5～0.7) μm×(2～3) μm，無芽孢，無莢膜，無鞭毛，多數(shù)有菌毛，革蘭氏陰性桿菌，直桿菌，形態(tài)似其他腸桿菌科的種。革蘭氏陰性，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，具有呼吸和發(fā)酵兩種類型的代謝。接觸酶陽性(只有1個(gè)種例外)，氧化酶陰性，有機(jī)化能營養(yǎng)型，發(fā)酵糖類不產(chǎn)氣(除了少數(shù)種產(chǎn)氣外)，不利用檸檬酸鹽或丙二酸鹽作為惟一碳源，KCN中不生長，不產(chǎn)H2S。是動(dòng)物的腸道致病菌，引起細(xì)菌性痢疾。以上特征與鑒定結(jié)果有較高切合度。

那么，志賀氏菌的致病機(jī)理有：菌毛能粘附于回腸末端和結(jié)腸粘膜的上皮細(xì)胞表面，繼而在侵襲蛋白作用下穿入上皮細(xì)胞內(nèi)，一般在粘膜固有層繁殖形成感染灶。此外，凡具有K抗原的痢疾桿菌，一般致病力較強(qiáng)；各型痢疾桿菌都具有強(qiáng)烈的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素作用于腸壁，使其通透性增高，促進(jìn)內(nèi)毒素吸收，引起發(fā)熱，神志障礙，甚至中毒性休克等。內(nèi)毒素能破壞粘膜，形成炎癥、潰湯，出現(xiàn)典型的膿血粘液便。內(nèi)毒素還作用于腸壁植物神經(jīng)系統(tǒng)，至腸功能紊亂、腸蠕動(dòng)失調(diào)和痙攣，尤其直腸括約肌痙攣?zhàn)顬槊黠@，出現(xiàn)腹痛、里急后重(頻繁便意)等癥狀；志賀氏菌A群Ⅰ型及部分2型菌株還可產(chǎn)生外毒素，稱志賀氏毒素，為蛋白質(zhì)，不耐熱，75～80 ℃環(huán)境下1 h被破壞。該毒素具有3種生物活性：①神經(jīng)毒性，將毒素注射家兔或小鼠，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起四肢麻痹、死亡；②細(xì)胞毒性，對(duì)腎細(xì)胞和HeLa細(xì)胞均有毒性；③腸毒性，具有類似大腸桿菌、霍亂弧菌腸毒素的活性，可以解釋疾病早期出現(xiàn)的水樣腹瀉。以上情況與剖檢結(jié)果基本一致。

2.3 緊急預(yù)防和治療措施

2019年7—10月，針對(duì)犢牛發(fā)生流行性腹瀉，雖全力救治，仍然發(fā)生100多頭犢牛死亡或淘汰，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前犢牛腹瀉發(fā)病死亡率高，預(yù)防和治療效果不明顯。

經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)6頭犢牛病料病原微生物分離檢測(cè)和藥敏實(shí)驗(yàn)，表明主要病原為志賀氏菌(痢疾桿菌)，篩選出3種敏感抗菌素用于防治，有一定效果。為此，詳細(xì)分析了病情，在綜合實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上提出當(dāng)前及后續(xù)解決問題的措施。

2.3.1 臨產(chǎn)牛 產(chǎn)前3 d肌肉注射敏感抗生素大觀霉素。建議劑量40 mg/kg體重，每天2次。

2.3.2 產(chǎn) 房 產(chǎn)房嚴(yán)格消毒，墊草厚度不小于20 cm，接生地面鋪設(shè)塑料布，嚴(yán)格杜絕犢牛出生后嘴與臟污物接觸，犢牛初乳喂量不低于2.5 kg。

2.3.3 犢 牛 出生后3～5 d肌肉注射大觀霉素。建議預(yù)防劑量20 mg/kg體重，每天1次；治療劑量40 mg/kg體重，每天2次。

對(duì)于發(fā)生腹瀉犢牛，治療原則保證不脫水，不酸中毒；胃管投服口服補(bǔ)液鹽，并保證能量(葡萄糖注射)。病情嚴(yán)重犢牛宜禁喂牛奶24 h。

2.3.4 犢牛飼喂方式 改變目前“母帶犢”的犢牛飼喂方式。學(xué)習(xí)奶牛公司犢牛培育模式，收集初乳，經(jīng)巴氏消毒后集中飼喂?fàn)倥?。必要時(shí)可以購買商品初乳，做好肉牛母牛擠奶保定架和擠奶、喂奶設(shè)備。