費裕翀,葉義全, 2,鄭 宏,路 錦,游云飛,黃 櫻,陳愛玲,曹光球, 2,*

1 福建農林大學林學院, 福州 350002 2 國家林業(yè)和草原杉木工程技術研究中心, 福州 350002 3 福建省洋口國有林場, 南平 353211 4 福建農林大學資源與環(huán)境學院, 福州 350002

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國南方重要的速生用材樹種之一,據(jù)第八次全國森林資源清查數(shù)據(jù)表明,我國杉木人工林種植面積為17×107hm2,種植面積及蓄積面積分別占人工林總面積的24%和28%,在我國森林系統(tǒng)中占據(jù)了重要地位[1- 2]。隨著林業(yè)集約生產水平的提高,杉木人工林獲得速生、豐產的同時,其地力下降現(xiàn)象已成為我國杉木人工林可持續(xù)經營的主要障礙。

凋落物的分解作為森林生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)和能量流動的主要途徑,是森林土壤養(yǎng)分的重要來源,加強有關杉木凋落物分解特性的研究對于杉木人工林地力的維持與提升具有重要意義。大量學者認為杉木凋落物中木質素含量較高和氮含量貧乏是導致其分解周期較長以及杉木人工林養(yǎng)分周轉較慢的重要原因[3],并傾向于將C/N比作為評判杉木凋落物底物質量和預測其分解速率的重要指標[4]。相關學者提出在凋落物分解過程中存在著某一C/N比臨界值[5- 6],當?shù)蚵湮镒陨鞢/N比值高于這一臨界值時,氮元素無法滿足微生物分解活動的需要,阻礙了胞外酶的分泌,使得凋落物分解緩慢,這也是底物質量較差的凋落物在分解初期常常出現(xiàn)養(yǎng)分富集現(xiàn)象的根本原因[7]。目前有關通過外源氮添加改善杉木凋落物底物質量的研究已有較多報道[3- 4],但此類研究并未總結外源氮添加背景下,C/N比的改變影響杉木凋落物分解的現(xiàn)有規(guī)律,杉木凋落物分解的內在機理仍有較大研究價值。

凋落物的分解包括淋洗作用、機械破碎、土壤動物的消化、微生物對化合物的酶解等過程,但凋落物的徹底降解則是在土壤微生物酶解作用下完成[8- 9],可以認為凋落物分解是基于細胞水平,細菌、真菌和放線菌等分解者共同參與,對凋落物中有機物質進行酶解和礦化的過程。長期以來的研究普遍認為相比于細菌,真菌在森林凋落物的分解過程中起著更為重要的作用,然而細菌作為土壤微生物中數(shù)量最高的群體,雖然對于新鮮凋落物的分解能力較弱,但細菌能夠以不同于其他微生物的作用方式改變著凋落物的物理結構和化學組成,促進真菌的定殖和土壤動物的攝食[10- 11]。此外相比于真菌,細菌對于角質及其他芳香族化合物具有更強的分解能力[12],在針葉類凋落物的分解過程中尤為重要。微生物快速的細胞分裂一方面需要大量富氮的RNA,外源氮的輸入在一定程度上增加了環(huán)境中氮的有效性,提升了微生物自身對于酶合成的能力[13]；而另一方面外源氮過量輸入可能造成環(huán)境中的氮超過土壤微生物所需的閾值,對其生命活動產生抑制作用[14],并使得纖維素、木質素與酚類物質等有機碳化合物產生聚合反應,形成結構穩(wěn)定,難以被微生物所利用的有機物質[15]。因此不同外源氮輸入量能夠直接或間接影響微生物結構與功能,進而影響森林凋落物的分解。

杉木人工林生態(tài)系統(tǒng)由于林分結構單一,普遍存在如固氮菌、纖維素分解菌以及氨化細菌等功能性微生物類群和數(shù)量退化的問題[16],而林下植被的發(fā)育演替對于人工林土壤微生物群落的多樣性和結構具有顯著影響[17]。通過對林下植被的撫育改善土壤微生物多樣性和群落結構,提升人工林養(yǎng)分周轉速率的內在微生物機制目前較少有人關注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),不同林下植被管理措施間的杉木人工林土壤理化性質和微生物群落結構均存在著較大差異[17-18]。通過測定不同林下植被管理措施杉木人工林中的凋落物微生物群落結構可能更有助于深入探究C/N比調控杉木凋落物分解的內在機制。有鑒于此,本研究以林下植被保留和林下植被去除2種林下植被管理措施下的杉木人工林為研究林分,通過施入外源氮改變杉木凋落葉的初始C/N比,觀測其在不同林分中分解300 d時的細菌群落結構差異,探討杉木凋落葉分解的內在C/N比值機理,從而進一步加深對杉木人工林生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)與反饋的認識。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 試驗材料來源

為保證杉木凋落葉養(yǎng)分含量基本一致,試驗材料取自福建省洋口國有林場南山管護站杉木中齡林樹體宿留枯死枝。將杉木凋落葉從收集的杉木枯死枝剝離后,帶回試驗室自然風干后備用。經測定,杉木凋落葉初始全氮含量為8.1 mg/g,全碳含量為482.5 mg/g,全磷含量為0.3 mg/g,C/N比值為60.9,C/P比值為1393.2,N/P比值為23.9,全鉀含量為2.9 mg/g,全鈣含量為4.2 mg/g,全鎂含量為1.3 mg/g,全錳含量為1.2 mg/g。

1.2 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于福建省南平市順昌縣洋口國有林場南山管護站(117°92′—118°64′E,26°87′—27°13′N),系武夷山脈南部,屬低山丘陵區(qū),光照充足,雨量充沛,夏季高溫多雨,冬季溫和濕潤,屬于中亞熱帶季風濕潤氣候。日照時數(shù)為1668—1972 h,無霜期254—305 d,年平均氣溫為18.6 ℃,極端最高氣溫41.4 ℃,極端最低氣溫-5.8 ℃,地區(qū)年降水量1600—1900 mm,年平均蒸發(fā)量為1308—1587 mm,相對濕度平均值為78%—82%。海拔252—339 m,平均坡度26—32°。土壤為山地紅壤,土層深度100 cm以上,土壤較肥沃。

1.3 試驗設計

2018年10月在福建省洋口國有林場南元管護站,根據(jù)海拔、坡度、坡向等立地條件基本一致的原則,選擇林下植被保留和林下植被去除共2種林下植被管理措施下的杉木人工林。2種林分造林時間均為1984年,種苗來源為杉木第1代種子園的優(yōu)良家系壯苗,初植密度為2505株/hm2,1997年進行撫育間伐,間伐強度約為50%,保留株數(shù)為1187株/hm2。間伐后的杉木人工林采取近自然化管理,使林下植被自然演化,減少人為干擾。林下植被保留林分采取近自然化管理至今,林分密度為958 株/hm2,平均樹高22.7 m,平均胸徑31.9 cm,林下灌木層主要為粗葉榕(Ficushirta)、杜莖山(Maesajaponica)、大葉紫珠(Callicarpakochiana)和木荷(Schimasuperba)等,草本主要為薄蓋短腸蕨(Allantodiahachijoensi)、金毛狗(Cibotiumbarometz)、觀音蓮座蕨(AngiopterisfokiensisHieron)和江南短腸蕨(Allantodiametteniana)等,草本層生物量6.7 t/hm2,林下植被總蓋度92%；林下植被去除林分自2012年7月起,每年進行1次林下植被清理,林下灌木清除采用割灌機,林下草本采用鐮刀手工割除,林分密度為983 株/hm2,平均樹高22.3 m,平均胸徑30.2 cm。2018年11月在2種林分下分別設置3個20 m×20 m樣地,并在樣地的4個角均打下水泥樁以作標記。不同林分類型土壤理化性質見表1。

參考相關文獻[19-20],本研究共設置具有不同C/N比的4類杉木凋落葉：C/N比值60.9(記做CK)；C/N比值40.6(記做N1,約為杉木凋落葉C/N原始值的2/3)；C/N比值30.5(記做N2,約為杉木凋落葉C/N原始值的1/2)；C/N比值20.3(記做N3,約為杉木凋落葉C/N原始值的1/3),各處理重復4次。準確稱取各樣品所需的(10.000±0.005) g杉木凋落葉,將其整齊、緊湊地平鋪于牛皮紙上。選取NaNO3作為氮源,根據(jù)前期預實驗以溶液形式將不同濃度的NaNO3溶液均勻噴施于葉面,待其風干后測定C/N比值,重復幾次,直至各處理樣品的杉木凋落葉C/N比達到實驗要求。將各處理的杉木凋落葉樣品分別裝入網(wǎng)眼0.5 mm、大小為20 cm×20 cm的尼龍分解袋中,于2018年12月分別放置于林下植被保留和林下植被去除共2種杉木人工林的3個預設樣地內。放置時去除地表凋落物層,每個分解袋之間間隔50 cm,貼上標簽,用竹釘固定四角在地表,保證分解袋緊貼表層土壤。每種處理分解袋縱向放置,處理間設置3 m的緩沖帶。

表1 樣地的土壤理化性質(0—20 cm)

分解袋放置300 d后進行取樣,每個樣地每個處理各取4袋,取樣時戴一次性手套,每個分解袋均單獨裝入自封袋中,其中3袋用刷子清除凋落葉所附著的沙土和植物根系等雜質,于烘箱中80 ℃烘干至恒質量,稱重后用粉碎機研磨過0.25 mm篩,用于測定凋落葉化學性質。各處理杉木凋落葉化學性質見表2。另1袋置于小型便攜冰柜中帶回試驗室,用經酒精消毒的剪刀將凋落葉剪碎裝入自封袋置于-80 ℃冰箱中保存,用于微生物群落多樣性的測定。

表2 凋落葉分解300 d后化學性質(n=3)

1.4 杉木凋落葉干質量剩余率和化學性質測定

干質量計算公式為y=1-(W0-Wt)/W0×100%y=1-(W0-Wt)/W0×100%,W0為凋落葉分解初始干質量(g),Wt為分解t時間后剩余的凋落葉干質量。全氮和全碳含量采用全自動碳氮分析儀(Elemental Analyzer Vario ELIII,德國)測定。全磷含量測定采用堿熔-鉬銻抗比色法,全鉀含量測定采用堿熔-火焰光度法,全鈣和全鎂含量測定采用EDTA絡合滴定法,全錳含量測定采用原子吸收分光光度法,以上分析方法參考文獻[21]。

1.5 杉木凋落葉細菌群落結構及多樣性測定

采用Mobio公司的PowerSoil DNA Isolation Kit微生物總DNA提取試劑盒提取杉木凋落葉總DNA。對提取后的DNA產物經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,合格DNA稀釋至1 ng/μL保存于-80 ℃用于PCR擴增。采用帶有barcode的特異引物擴增16S rRNA的V3+V4區(qū),引物序列為341F：CCTACGGGNGGCWGCAG和806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT。PCR反應體系：2.5 μL細菌模板DNA(5 ng/μL),上游引物和下游引物各5 μL(引物濃度1 μmol/μL),12.5 μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix。擴增程序為：95 ℃預變性2 min,隨后98 ℃變性10 s,62 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,共27個循環(huán)后68 ℃延伸10 min。對擴增產物切膠回收,使用QuantiFluorTM熒光計進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合,連接測序接頭,使用New England Biolabs公司的NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測,合格后使用Hiseq2500(Illumina,SanDiego,CA,USA)的PE250模式上機測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用FLASH軟件對原始數(shù)據(jù)進行質量過濾和雙端序列的拼接,得到有效數(shù)據(jù)[22]。采用Uparse軟件,對相似度≥97%的序列歸為1個操作分類單元即OTU(Operational taxonomic unit)[23]并利用Greengene數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。運用Qiime軟件對所得優(yōu)質序列進行OTU聚類和物種分類分析,對OTUs進行豐度、多樣性指數(shù)等分析。運用R軟件進行聚類分析、典范對應分析和方差分解分析。運用Lefse 1.0軟件對組間差異進行分析。運用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及Person相關性分析,使用由Origin 10.5和Exce1 2016軟件處理進行作圖。

2 結果與分析

2.1 分解300 d后杉木凋落葉干質量剩余率

由表3可知,外源氮的輸入對于杉木凋落葉的分解具有低促高抑的作用。除N3處理,林下植被保留林分下的杉木凋落葉干質量剩余率均低于林下植被去除林分,可見林下植被保留管理措施更有利于杉木凋落葉的分解。但相比于林下植被去除林分,過低的初始C/N比對于林下植被保留林分中杉木凋落葉分解的抑制作用則更為明顯。

表3 杉木凋落葉分解300 d后干質量剩余率/%

2.2 杉木凋落葉細菌多樣性指數(shù)

去除掉低質量的序列后,樣本平均序列條數(shù)為92549,將所有序列按97%的相似度進行OTU分類,所得的OTU總數(shù)為86427個,平均每個樣品的OTU數(shù)目是3601個,結合表4中的Goods_coverage指數(shù),可認為測序深度增加已不影響物種多樣性,測序量足夠,雖仍有少量微生物種群未被發(fā)現(xiàn),但所得數(shù)據(jù)已基本反映凋杉木落葉中微生物群落結構組成,置信度較高。由表4可知,外源氮的輸入對于杉木凋落葉細菌群落的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)普遍具有低促高抑的效應,一定范圍內初始C/N比的降低有利于提升杉木凋落葉細菌群落多樣性。就林分差異而言,林下植被保留林分中杉木凋落葉細菌群落的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均高于林下植被去除林分中相同處理,表明林下植被保留林分中杉木凋落葉細菌群落多樣性指數(shù)高于林下植被去除林分。但方差分析表明,不同處理間杉木凋落葉的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)差異普遍未達顯著水平,不同初始C/N比對同一地區(qū)同一樹種凋落葉的細菌群落多樣性影響較小。

2.3 杉木凋落葉細菌聚類分析

基于OTU列表的物種豐度信息,開展聚類(PCoA,Principal co-ordinates analysis),利用降維的思想研究樣本的組成距離關系,分析結果中,樣品組成越相似,反映在PCoA圖中的距離越近。如圖1所示,林下植被保留林分中除N1處理下的杉木凋落葉各樣品的聚集效應較差,其他處理下的各樣品聚集效應較好,其中CK和N3處理下的杉木凋落葉樣品細菌群落結構具有聚集效應,而與N2處理下的樣品圍繞第一主成分基本分開,表明兩者間細菌群落結構相近,與N2處理細菌群落結構差異較大。林下植被去除林分中各處理下的杉木凋落葉聚集效應總體較好,除N1和N2處理下的杉木凋落葉樣品細菌群落結構具有聚集效應,兩者間細菌群落結構相近,其他處理下的樣品則總體呈分離效應,各處理間細菌群落結構差異較大。采用Anosim檢驗(表5)對組間細菌群落相似度進行非參數(shù)檢驗,結果表明各處理間細菌群落結構普遍存在顯著差異。

表4 杉木凋落葉細菌群落多樣性指數(shù)

圖1 杉木凋落葉細菌群落聚類圖Fig.1 Clustering of bacterial community of Cunninghamia lanceolata litters

表5 組間細菌群落結構差異Anosim顯著性檢驗

2.4 杉木凋落葉細菌群落結構

由圖2可知,在細菌門分類水平上相對豐度前十的細菌種群為：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、裝甲菌門(Armatimonadetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。變形菌門、放線菌門和浮霉菌門的相對豐度在各樣品中均大于10%,為主要優(yōu)勢種群,其中林下植被保留林分中杉木凋落葉的放線菌、綠彎菌和芽單胞菌相對豐度均高于林下植被去除林分中相同處理,浮霉菌則相反。由圖3可知,在細菌屬分類水平上相對豐度前十的細菌種群為：慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)、Singulisphaera屬、出芽菌屬(Gemmata)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、Jatrophihabitans屬、游動放線菌屬(Actinoplanes)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)和動孢囊菌屬(Kineosporia)。就林分差異而言,林下植被保留林分中杉木凋落葉Singulisphaera屬和Jatrophihabitans屬的相對豐度總體低于林下植被去除林分中相同處理。

圖2 杉木凋落葉細菌群落物種分布堆疊圖(門) Fig.2 Stacking diagram of species distribution of bacterial community of Cunninghamia lanceolata litters (Phylum)

圖3 杉木凋落葉細菌群落物種分布堆疊圖(屬) Fig.3 Stacking diagram of species distribution of bacterial community of Cunninghamia lanceolata litters (Genus)

為進一步探究各處理下的杉木凋落葉具有指示作用的微生物種群,本研究通過LEFse分析組間種群差異,以LDA柱狀圖(默認閾值：LDA>2)以及進化分支圖進行顯示。由圖4可知,林下保留林分中N3處理下的杉木凋落葉無顯著差異細菌種群；CK處理下相對豐度顯著較高的細菌種群數(shù)最多,主要為變形菌門中的多類細菌,如伯克氏菌屬(Paucimonas)、Kaistia屬、玫瑰球菌屬(Roseococcus)、Methylophaga屬、Aetherobacter屬等,此外藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌門以及擬桿菌門中同樣存在多類細菌種群相對豐度顯著較高；與CK處理相似,N1處理下相對豐度顯著較高的細菌種群同樣主要為變形菌和放線菌門中的多類細菌,如紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、Rhizobiale屬,小月菌屬(Microlunatus)和中村氏菌屬(Nakamurella)等；N2處理下相對豐度顯著較高的細菌種群僅有酸桿菌門中的Terracidiphilus屬。

圖4 林下植被保留措施下基于分類等級樹的組間細菌種群差異展示圖Fig.4 A diagram of bacterial population differences between groups based on taxonomic tree under undergrowth vegetation preservationA, Terracidiphilus; b, Hevea_brasiliensis_phytoplasma; c, 中村氏菌屬 Nakamurella; d, 中村氏菌科 Nakamurellaceae; e, 小月菌屬 Microlunatus; f: Solirubrobacter; g, Solirubrobacteraceae; h, 纖維素降解菌屬 Chryseolinea; i, Vampirovibrionales; j, A0839; k: BCf3_20; l, 紅假單胞菌屬 Rhodopseudomonas; m, Kaistia; n, 玫瑰球菌屬 Roseococcus; o, 玫瑰單胞菌屬 Roseomonas; p, 伯克氏菌屬 Paucimonas; q, Bdellovibrio_sp_ETB; r, Aetherobacter; s, Methylophaga

圖5 林下植被去除措施下基于分類等級樹的組間細菌種群差異展示圖Fig.5 A diagram of bacterial population differences between groups based on taxonomic tree under undergrowth vegetation removalA, Saccharibacteria; b, Acidobacteriaceae_bacterium_SK_11; c, Phytoplasma_sp_RYL_GD; d, 鏈球菌屬 Streptococcus; e, Rhodopila_globiformis

由圖5可知,林下植被去除林分中,CK處理下的杉木凋落葉無顯著差異細菌種群；N1處理下相對豐度顯著較高的細菌種群為鏈球菌屬(Streptococcus)和Rhodopila_globiformis,分別從屬于厚壁菌門和變形菌門的紅球狀菌屬(Rhodopila)；N2處理下相對豐度顯著較高的細菌種群為Phytoplasma_sp_RYL_GD和Saccharibacteria門,Phytoplasma_sp_RYL_GD從屬于放線菌門沼桿菌屬(Patulibacter)；N3處理下相對豐度顯著較高的細菌種群為Acidobacteriaceae_bacterium_SK_11,Acidobacteriaceae_bacterium_SK_11從屬于酸桿菌門Acidicapsa屬。

2.5 杉木凋落葉化學性質與細菌多樣性指數(shù)的相關分析

由表6可知,杉木凋落葉C/P比值與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)呈顯著正相關；鉀含量與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)和呈顯著負相關,與Goods_coverage指數(shù)呈顯著正相關；鈣含量與Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈極顯著正相關；鎂含量與Ace指數(shù)呈顯著正相關,與Goods_coverage指數(shù)呈顯著負相關；錳含量與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)呈顯著負相關。

表6 杉木人工林凋落葉化學性質與細菌群落多樣性的相關性

2.6 杉木凋落葉化學性質與主要細菌種群相對豐度的相關分析

由圖6可知,在門分類水平,變形菌相對豐度與杉木凋落葉全氮含量呈顯著負相關,與C/N比值呈極顯著正相關,與C/P比值呈顯著正相關；放線菌相對豐度與全氮含量呈顯著負相關,與C/N和C/P比值呈極顯著負相關；浮霉菌相對豐度與全鎂含量呈顯著正相關；酸桿菌相對豐度與N/P比值呈顯著正相關；擬桿菌門相對豐度與全碳含量、C/N比值和C/P比值呈極顯著正相關,與全氮含量和全鉀含量呈顯著負相關；綠彎菌相對豐度與全鎂含量呈顯著負相關；疣微菌相對豐度與全碳含量和C/N比值呈顯著正相關；芽單胞菌相對豐度與全錳含量呈顯著正相關；裝甲菌相對豐度與全氮含量呈極顯著負相關,與C/N比值呈顯著正相關?？梢娫陂T分類水平,杉木凋落葉C/N比值與主要細菌種群相對豐度的相關性最高。

在屬分類水平,嗜酸棲熱菌相對豐度與杉木凋落葉全碳含量和C/N比值呈極顯著負相關,與全氮含量呈顯著正相關,與全鉀含量呈極顯著正相關；Singulisphaera屬相對豐度與全鎂含量呈極顯著正相關；鞘氨醇單胞菌相對豐度與全碳含量和C/N比值呈極顯著正相關,與全氮含量和呈顯著負相關,與全鉀含量呈極顯著負相關；Jatrophihabitans屬相對豐度與全碳含呈極顯著負相關,與C/N和C/P比值呈顯著負相關,與全鎂含量呈極顯著正相關；游動放線菌相對豐度與全錳含量呈顯著正相關；沼桿菌相對豐度與全碳含量和C/N比值呈顯著正相關,與全鉀含量呈顯著負相關；Acidicapsa屬相對豐度與全鎂含量呈顯著正相關；Terracidiphilus屬相對豐度與全碳含量呈顯著負相關,與C/N比值呈極顯著負相關,與全鉀含量呈極顯著正相關；紅球狀菌相對豐度與N/P比值呈顯著正相關；蛭弧菌(Bdellovibrio)相對豐度與全碳含量和C/N比值呈極顯著正相關,與C/P和N/P比值呈顯著正相關,與全鉀含量呈顯著負相關；中村氏菌相對豐度與全鉀含量呈顯著負相關；小月菌屬相對豐度與杉木凋落葉全錳含量呈顯著正相關；Aetherobacter屬相對豐度與全磷含量呈顯著正相關,與全錳含量呈極顯著正相關?？梢娫趯俜诸愃?杉木凋落葉全碳含量、C/N比值和全鉀含量與主要細菌種群相對豐度的相關性最高。

圖6 杉木凋落葉化學性質與主要細菌種群相關性熱圖Fig.7 Heat map of correlation between main bacterial population and chemical properties of Cunninghamia lanceolata littersTC, 全碳 Total carbon; TN, 全氮 Total nitrogen; TP, 全磷 Total phosphorus; C/N, 碳氮比 C/N ratio; C/P, 碳磷比 C/P ratio; N/P, 氮磷比 N/P ratio; TK, 全鉀 Total potassium; TCa, 全鈣 Total calcium; TMg, 全鎂 Total magnesium; TMn, 全錳 Total manganese, * P<0.05, ** P<0.01

2.7 杉木凋落葉細菌群落結構影響因子分析

本研究使用了典范對應分析(CCA,Canonical correspondence analysis)和方差分解分析(VPA,Variance partitioning analysis)研究杉木凋落葉化學性質與細菌群落之間關系。由圖7可知,在門分類水平上第一主坐標軸解釋了細菌群落結構30.7%的變異,第二主坐標解釋了23.9%的變異,除全鈣含量外,其余指標與杉木凋落葉細菌群落結構變異均具有較高的相關性,全碳含量、全氮含量,C/N比值、C/P比值、N/P比值、全鉀含量、全鎂含量和全錳含量對門分類水平上細菌群落結構變異的解釋度分別為：9.8%、6.2%、2.2%、20.9%、17.2%、4.8%、3.6%、3.5%和1.8%。屬分類水平上,第一主坐標軸解釋了細菌群落結構44.1%的變異,第二主坐標解釋了31.3%的變異,其中杉木凋落葉全碳含量、全氮含量,C/N比值、C/P比值、全鉀含量和全鎂含量與杉木凋落葉細菌群落結構變異的相關性較高,以上指標對屬分類水平上細菌群落結構變異的解釋度分別為：11.0%、7.5%、12.8%、5.1%、16.1%和0.3%。

圖7 杉木凋落葉細菌種群典范對應分析Fig.7 Canonical correspondence analysis of bacterial community of Cunninghamia lanceolata litters

3 討論

3.1 不同初始C/N比杉木凋落葉分解300 d后細菌多樣性和群落結構的差異

受底物質量限制,杉木凋落物分解緩慢,周轉期普遍需要4—5年[24],本研究表明一定范圍內,初始C/N比的降低有利于杉木凋落葉的分解。由于固氮菌與纖維素分解菌存在著互生關系,后者為前者提供豐富的碳源,前者為后者提供氮元素[25],可見本研究中適量的外源氮輸入能夠提升凋落物質量水平,滿足了分解者生命活動所需的氮,從而加速了杉木凋落葉的分解。相關學者認為相比于真菌,細菌在凋落物分解后期起著更為主要的作用[26-27],但本研究Anosim檢驗顯示,具有不同初始C/N比值的杉木凋落葉在分解300 d時細菌群落結構已然具有明顯差異。分解300 d時,變形菌門、放線菌門和浮霉菌門的相對豐度在各處理杉木凋落葉中相對豐度均大于10%,為主要優(yōu)勢種群,這與相關研究結果基本一致[28]。變形菌門和放線菌門是森林凋落物分解轉化的主要種群,2門細菌中多類細菌種群屬于腐生菌,參與纖維素和木質素的分解[29-30],LEFse分析表明,變形菌門和放線菌門中多類細菌種群相對豐度在不同處理間的杉木凋落葉中具有顯著差異,且兩者相對豐度與杉木凋落葉C/N比值具有顯著相關關系。這可能表明變形菌門和放線菌門是杉木凋落葉在外源氮素調控下所影響的重要細菌門類,杉木凋落葉的初始C/N比影響著變形菌門和放線菌門的生長繁殖,進而作用于杉木凋落葉分解。值得注意的是本研究結果表明,外源氮的輸入對于杉木凋落葉中變形菌門相對豐度具有低促高抑的作用,相關性分析則表明變形菌相對豐度與C/N比呈極顯著正相關,而相關研究認為變形菌門是一類富營養(yǎng)型菌[28]?？梢姰擟/N比過低時將導致其相對豐度的降低,這同樣可能是N3處理下的杉木凋落葉干質量剩余率較高的重要原因。根據(jù)本課題組對該試驗林分的土壤細菌的研究結果發(fā)現(xiàn)[17],相比于該林分土壤,杉木凋落葉中的浮霉菌門、擬桿菌門、裝甲菌門相對豐度顯著上升,產生該差異的原因可能是由于取樣時間的不同所導致,但更有可能是該幾門細菌直接或協(xié)同其他微生物種群參與了對杉木凋落葉的分解。細菌作為異養(yǎng)生物,由于其分解利用所喜好的有機化合物類型的差異,相比于土壤,參與纖維素和木質素分解的細菌種群可能在杉木凋落葉中大量聚集生長,相對豐度明顯上升。而已有研究證實浮霉菌門和裝甲菌門具有降解多環(huán)芳烴類化合物的作用,促進有機碳的礦化[31-32],擬桿菌門則具有直接參與木質纖維素的降解[33]。在屬分類水平上,也同樣證實慢生根瘤菌屬、嗜酸棲熱菌屬、出芽菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等多類細菌為土壤中參與碳氮循環(huán)的重要細菌種群[34-37]。由于不同的樹種凋落物中所含碳源類型的不同,穩(wěn)定的林分環(huán)境驅使著土壤微生物集群定向進化,形成所謂的主場效應[28],故而杉木凋落葉實際上起到了細菌的培養(yǎng)基質的作用,基本可認定以上細菌是該地區(qū)杉木人工林生態(tài)系統(tǒng)主導凋落物分解的主要細菌種群。

外源氮的輸入對于杉木凋落葉細菌群落多樣性具有低促高抑的效應,外源氮的輸入為細菌提供了富營養(yǎng)生境,有利于杉木凋落葉的細菌群落多樣性的提升。但當C/N比過低時,將使得某些專性細菌大量繁殖,致使杉木凋落葉細菌群落結構多樣性下降。例如LEFse分析中就發(fā)現(xiàn)林下植被去除林分中N3處理下的杉木凋落葉中酸桿菌門中的Acidobacteriaceae_bacterium_SK_11,以及林下植被保留林分中N2處理下的酸桿菌門的Terracidiphilus屬的相對豐度顯著上升。酸桿菌屬嗜酸性細菌[38],這可能指示著外源氮的過量輸入導致細菌所處生境酸化,不利于其他細菌種群生存繁殖。就林分差異而言,林下植被保留林分中杉木凋落葉細菌群落的多樣性指數(shù)均高于林下植被去除林分中相同處理。Benizri等[39]研究表明,微生物多樣性與林內物種多樣性呈顯著正相關,杉木人工林群落結構單一,豐富多樣的林下植被使得杉木人工林森林生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)趨于復雜,環(huán)境趨于異質化,并有利于土壤中養(yǎng)分的積累,細菌種群也隨之增多。由于研究普遍認為,微生物種群多樣性的提高有利于提升林分抗逆性和養(yǎng)分周轉能力[16],故而林下植被保留管理措施可能更有利于杉木人工林凋落物的分解。但值得注意的是,相比于林下植被去除林分,過低的初始C/N比對于林下植被保留林分中杉木凋落葉分解的抑制作用更為明顯,這可能與外源氮對于杉木凋落葉分解的調控作用受林分環(huán)境影響有關。與林下植被去除林分相比,林下植被保留林分中土壤氮含量較高,環(huán)境中氮的含量更易超過土壤微生物所需的閾值,細菌種群多樣性下降,進而導致分解速率變緩。

杉木人工林目前面臨著土壤質量下降、生產力降低、連栽更新障礙等困境,如何認識杉木人工林土壤中的微生物差異和功能并在經營管理中加以利用就顯得尤為重要。未來有必要采用功能基因組學技術在獲取微生物群落結構信息的同時,對其中有機碳降解以及氮磷循環(huán)等功能基因的多樣性和結構進行研究,從而對外源氮素調控下杉木凋落葉內在的微生物分解機制有著更進一步的研究。此外,由于杉木凋落葉周轉期較久,加之不同的微生物種群對于凋落物中碳源選擇能力的差異,不同分解階段微生物群落結構有所不同,杉木凋落葉中的微生物群落結構有待進一步的跟蹤測定。

3.2 細菌群落多樣性與杉木凋落葉化學性質的關系

相關性分析表明在門和屬分類水平,均發(fā)現(xiàn)杉木凋落葉C/N比與主要細菌種群相對豐度的相關性最為緊密,表明對于細菌多類種群而言,適宜的碳氮計量比例對其具有重要意義。而鈣元素和鎂元素含量與杉木凋落葉細菌群落多樣性具有顯著相關性,表明除了碳、氮、磷以外,鈣、鎂等元素同樣是影響細菌群落多樣性的重要因子,其含量的提高可為更多的細菌生長提供有利的環(huán)境條件。典范對應分析和方差分解分析表明,在門分類水平杉木凋落葉C/P比值和N/P比值對細菌群落結構分布變異具有較高解釋度,在屬分類水平杉木凋落葉鉀含量對細菌群落結構分布變異具有較高解釋度。驅動生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中微生物的分解活動需要多種化學元素以及適應的養(yǎng)分計量比例,而磷元素和鉀元素同樣在其中發(fā)揮了重要作用[40-41]。通過對該林分土壤細菌群落結構的進行測定,結果也同樣表明土壤全磷含量對細菌群落結構影響顯著[17],本研究區(qū)地處亞熱帶,土壤多呈酸性反應,淋溶作用強烈,磷元素和鉀元素相對耗竭,在碳源和氮源充沛的條件下,兩者可能是該生態(tài)系統(tǒng)中影響杉木凋落葉細菌群落結構差異更為重要的限制因子。此外較多細菌種群相對豐度與鎂元素和錳元素含量呈顯著正相關,如Singulisphaera屬、Jatrophihabitans屬、小月菌屬和Aetherobacter屬等。由于亞熱帶地區(qū)高溫多雨易造成土壤中鎂和錳的淋溶的缺乏,尤其主導木質素分解的錳過氧化物酶本身就是一類需要錳元素參與合成的土壤胞外酶,而相關研究表明大約需要25種化學元素才能驅動整個生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中的樹木生長、分解、微生物繁殖[42],在未來的研究中其他中微量元素在凋落物分解過程中的重要作用應加以重視。同時本研究發(fā)現(xiàn),凋落物的分解速率不僅受底物質量的限制,與所在分解環(huán)境也密切相關,在設計試驗方案時對林分環(huán)境,尤其是表層土壤中的化學元素含量需加以考量。

4 結論

本研究采用高通量測序技術,對不同林分環(huán)境中,不同C/N比杉木凋落葉分解300 d時細菌群落結構進行測定,揭示了杉木人工林養(yǎng)分周轉的內在微生物機理。結果表明變形菌門、放線菌門和浮霉菌門為本研究區(qū)分解杉木凋落葉主要細菌種群,杉木凋落葉初始C/N比值降低改變了變形菌門、放線菌門和酸桿菌門等細菌門中的多類細菌的相對豐度,進而調控了杉木凋落葉的分解。林下植被保留措施下的杉木人工林杉木凋落葉細菌群落多樣性更高,更有利于杉木凋落葉的分解。

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