鄭董璇，張可鋒，晉 玲，鐘明利，趙唐蓮，曹后康，段小群*，高 雅*

1桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由各種有害刺激，包括病毒感染、藥物毒性、酒精和自身免疫性肝病的持續(xù)傷口愈合反應(yīng)對(duì)肝臟損傷所致[1]。它是慢性肝病的重要病理標(biāo)志，是肝硬化發(fā)生的關(guān)鍵事件，也是終末期肝細(xì)胞癌和晚期肝硬化的主要病因[2,3]。秋水仙素作為肝纖維化和肝硬化的臨床用藥，主要抑制肝星狀細(xì)胞早期的活化與增殖，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡，干擾膠原代謝，針對(duì)不同病因?qū)е碌腍F秋水仙素治療效果不一，并且秋水仙素會(huì)引起許多副作用，例如腹痛、惡心、食欲不振等，高劑量服用后還會(huì)導(dǎo)致肝腎功能衰竭[4]，因此仍需研究并開(kāi)發(fā)新的安全有效的治療藥物。狗肝菜(Diclipterachinensis(L.) Juss)作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，味甘性涼，具有清熱，涼血，利尿，解毒平肝等功效，對(duì)CCl4、D-氨基半乳糖鹽酸和脂多糖等多種類型的肝損傷模型具有緩解作用[5]；本課題組在先前研究中發(fā)現(xiàn)，狗肝菜多糖(DCP)對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂尚有良好的抑制作用，其機(jī)理主要與緩解炎癥反應(yīng)和抑制氧化應(yīng)激有關(guān)[6]。LIN28A是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、調(diào)節(jié)發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝等方面發(fā)揮著重要作用，在諸如食道癌[7]、卵巢癌[8]等多種癌細(xì)胞中，均發(fā)現(xiàn)存在LIN28A的過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。有研究表明，肝臟特異性缺失LIN28A可緩解小鼠肝細(xì)胞癌并有效延長(zhǎng)患癌小鼠壽命[9]，這提示LIN28A可能成為治療肝細(xì)胞癌或肝臟疾病的潛在靶點(diǎn)。但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道其與HF的關(guān)聯(lián)性，此文章旨在探索LIN28A與HF的關(guān)聯(lián)性并研究DCP能否通過(guò)抑制LIN28A起到保護(hù)肝臟的作用。

1 材料與試劑

1.1 試驗(yàn)藥物與試劑

狗肝菜多糖(由本課題組所在實(shí)驗(yàn)室提取制備[6])；分析純CCl4(廣東汕頭市西隴化工廠)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(南通市碧云天生物技術(shù)研究所)；秋水仙素(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，純度>99%)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美國(guó))；LIN28A抗體、核因子-κB p65(NF-κBp65)抗體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)子-β1(TGF-β1)、抗體基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體、環(huán)氧化酶-2(COX-2)抗體和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體(Abcam，英國(guó))；GAPDH抗體(Abcam，英國(guó))；辣根標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(Bioworld，美國(guó))；Super ECL Plus超敏發(fā)光液(上海雅酶生物科技有限公司)；PCR檢測(cè)試劑盒(EZbioscience，美國(guó))；透明質(zhì)酸(HA)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；Ⅳ型膠原蛋白(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)ELISA試劑盒(上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)；層粘連蛋白(LN)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PMSF(北京索萊寶科技有限公司)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動(dòng)物

60只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重180～220 g，購(gòu)買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。

1.3 儀器

ZD-9550臺(tái)式振蕩器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；Centrifuge 5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))；O1ympus BX51顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)；SpectraMax i3X酶標(biāo)儀(美谷分子儀器(上海)有限公司)；電泳基礎(chǔ)電源(Bio-Rad公司，美國(guó))；7500 RT-PCR system(ThermoFisher公司，美國(guó))；CLINX化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 造模與給藥

60只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂食1周后，隨機(jī)分成6組，即正常組、模型組、秋水仙素(0.12 mg/kg)組、DCP低劑量(DCP low dose，DCP-L；50 mg/kg)組、DCP中劑量(DCP medium dose，DCP-M；100 mg/kg)組和DCP高劑量(DCP high dose，DCP-H；200 mg/kg)組，每組10只。除正常組外，其余大鼠均每周腹腔注射2次40%的CCl4橄欖油溶液(1 mL/kg)，建立HF大鼠模型，正常組大鼠以相同劑量腹腔注射純橄欖油。每日根據(jù)體重，給予秋水仙素組和DCP低中高劑量組大鼠相應(yīng)的藥物治療，正常組與模型組大鼠按照相同計(jì)算方式灌胃蒸餾水，持續(xù)6周。末次給藥后，所有大鼠禁食不禁水16 h，乙醚麻醉后腹腔靜脈取血，收集肝臟。

2.2 檢測(cè)肝臟病理學(xué)

取各組大鼠相同位置1 cm正方大小的肝臟，浸泡于4%多聚甲醛組織固定液中48 h，進(jìn)行包埋切片后，攤片烘片，脫蠟至水，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色和Masson染色后在O1ympus BX51光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

2.3 DCP對(duì)HF大鼠血清HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C的影響

大鼠血液室溫靜置2 h后，于4 ℃條件下，4 500 rpm離心10 min后取上層血清。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C含量。

2.4 檢測(cè)肝臟炎癥因子

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)測(cè)定大鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。稱取肝臟組織(80～100 mg)，按質(zhì)量體積比1∶9加入裂解液，冰水浴中電動(dòng)勻漿機(jī)破碎，于4 ℃條件下，12 000 rpm離心15 min后取上清保存作為檢測(cè)樣品。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量測(cè)定。

2.5 測(cè)定mRNA相對(duì)含量

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測(cè)定肝臟組織中α-SMA、TGF-β1、LIN28A、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOS的相對(duì)含量。取各組大鼠肝臟組織約100 mg，準(zhǔn)確加入1 mL Trizol(ThermoFisher公司，美國(guó))，冰上研磨。加入0.2 mL氯仿劇烈震蕩后靜置5 min，4 ℃下10 000 rpm離心15 min，取上層水相加入等體積的異丙醇，靜置10 min后4 ℃下10 000 rpm離心10 min，棄上清并用預(yù)冷75%乙醇洗滌RNA沉淀，4 ℃下5 000 rpm離心5 min，棄上清。離心管干燥5 min后加入0.2 mL去酶水，置于55 ℃水浴鍋中10 min，制備RNA樣品。上機(jī)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA樣品，嚴(yán)格按照試劑盒要求，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行肝臟組織中α-SMA、TGF-β1、LIN28A、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOS的相對(duì)含量測(cè)定。各基因的引物序列見(jiàn)表1。

2.6 測(cè)定大鼠肝臟蛋白表達(dá)

采用蛋白免疫印跡法(Western blot)測(cè)定肝組織中LIN28A、α-SMA、TGF-β1、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOS蛋白的表達(dá)水平。取各組大鼠肝組織約60 mg，加入含1%PMSF的RIPA裂解液1 mL冰上研磨至無(wú)肉眼可見(jiàn)組織，4 ℃條件下12 000 rpm離心10 min后收集上清液。另取少量上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白含量。按相應(yīng)比例加入Loading buffer，沸水浴10 min后備用。

表1 引物序列

根據(jù)蛋白含量測(cè)定結(jié)果，調(diào)整蛋白樣品上樣量后進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳。于200 mA冰水浴轉(zhuǎn)膜2 h，5%封閉液封閉2 h。加入相應(yīng)一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃下?lián)u床過(guò)夜；次日，TBST洗滌，條件同上，根據(jù)一抗基源動(dòng)物加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(稀釋比例為1∶5 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗滌3次，滴加顯色液，使用CLINX化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，使用Quantity One對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 DCP對(duì)HF大鼠肝臟形態(tài)的影響

H&E染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊且飽滿。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)受損，且伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。相較于模型組，秋水仙素組和DCP低中高劑量大鼠肝小葉清晰，肝細(xì)胞變性現(xiàn)象有所改善，表明DCP可改善CCl4造成的大鼠肝臟損傷進(jìn)而減緩纖維化進(jìn)程(見(jiàn)圖1)。

Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝臟肝細(xì)胞致密排列，無(wú)明顯藍(lán)色膠原沉積。模型組大鼠肝組織出現(xiàn)大量膠原沉積，有嚴(yán)重的纖維化現(xiàn)象。相較于模型組，秋水仙素組和DCP低中高劑量組肝臟病變有不同程度的減輕，且DCP高劑量組減輕程度明顯(見(jiàn)圖2)。

圖1 大鼠肝臟切片的HE染色(×200)Fig.1 Photomicrograph of rats liver sections stained with H&E (×200)注：A：正常組；B：模型組；C：秋水仙素組；D：DCP-L；E：DCP-M；F：DCP-H；下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Colchicine group;D:DCP-L;E:DCP-M;F:DCP-H;The same below.

圖2 大鼠肝臟切片的Masson染色(×100)Fig.2 Photomicrograph of rats liver sections stained with Masson (×100)

3.2 DCP對(duì)HF大鼠血清HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C的影響

相較于正常組，模型組大鼠血清中HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C含量均有顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，說(shuō)明肝細(xì)胞通透性改變，提示造模成功。相較于模型組大鼠，DCP低中高劑量組大鼠血清中上述指標(biāo)均有不同程度的降低，且DCP高劑量組各指標(biāo)均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，提示DCP可緩解由CCl4造成的大鼠肝細(xì)胞損傷(見(jiàn)表2)。

表2 DCP對(duì)血清中HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C的影響

3.3 DCP對(duì)HF大鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

模型組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α含量較正常組大鼠均有顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。DCP低中高劑量組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量較模型組大鼠均有不同程度的降低，且DCP高劑量組各指標(biāo)均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，此結(jié)果表示DCP可緩解CCl4引起的肝臟炎癥反應(yīng)和炎癥介質(zhì)的釋放(見(jiàn)表3)。

表3 DCP對(duì)肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

3.4 PCR檢測(cè)LIN28A、α-SMA、TGF-β1、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOS

相較于正常組，模型組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、LIN28A、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOS的mRNA相對(duì)含量均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；相較于模型組大鼠，DCP低中高劑量組均可明顯抑制上述蛋白的mRNA相對(duì)含量，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，此結(jié)果表明DCP抗肝纖維化可能與LIN28A/NF-κBp65信號(hào)通路有關(guān)(見(jiàn)表4、5)。

表4 DCP對(duì)肝臟中α-SMA和TGF-β1mRNA相對(duì)含量的影響

表5 DCP對(duì)肝臟中LIN28A、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOSmRNA相對(duì)含量的影響

3.5 Western blot檢測(cè)LIN28A、α-SMA、TGF-β1、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOS

相較于正常組，模型組大鼠肝組織中LIN28A、α-SMA、TGF-β1、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOS蛋白表達(dá)量均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；DCP低中高劑量組較模型組大鼠均可不同程度抑制上述蛋白的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，此結(jié)果再次驗(yàn)證DCP可能通過(guò)LIN28A/NF-κB信號(hào)通路起到抗肝纖維化作用(見(jiàn)圖3)。

圖3 DCP對(duì)TGF-β1、α-SMA、LIN28A、NF-κBp65、MMP9、COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect on the TGF-β1, α-SMA, LIN28A, NF-κBp65, MMP9, COX-2 and iNOS protein of DCP

4 討論

肝纖維化是一種病理病變，以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝周隙的進(jìn)行性積聚為特征，是慢性肝病的主要問(wèn)題[10]。由于其最終會(huì)導(dǎo)致肝硬化，成為世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡的主要原因，據(jù)估計(jì)全球2%的人口會(huì)受到肝硬化的影響[11]。因此，研究DCP對(duì)肝臟的保護(hù)作用具有重要意義。

該實(shí)驗(yàn)采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化，其造成的病理改變與人體臨床HF極為相似[12,13]。HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C是肝細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在肝纖維化中由于細(xì)胞外基質(zhì)合成增多、降解不足，故其指標(biāo)水平升高程度與肝纖維化程度呈現(xiàn)正相關(guān)[14]。本研究中，模型組大鼠HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C含量明顯上升，H&E染色與Masson染色結(jié)果顯示模型組大鼠肝臟組織脂肪變性和膠原沉積現(xiàn)象明顯，提示造模成功。DCP給藥后，大鼠血清中HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C含量顯著下降，H&E染色病理改變有所緩解，顯示DCP對(duì)肝臟以及肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控大量對(duì)細(xì)胞凋亡和炎癥的調(diào)節(jié)有重要作用的基因[15]。當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，NF-κB被激活并釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子，導(dǎo)致肝組織炎癥反應(yīng)加劇[16]。在炎癥部位誘導(dǎo)酶COX-2和iNOS表達(dá)也會(huì)提高，產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)，也作為炎癥標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織NF-κBp65、COX-2和iNOS的mRNA相對(duì)含量和蛋白表達(dá)水平顯著提高，并且TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相對(duì)含量也有明顯升高；相較于模型組，DCP低中高劑量各組大鼠肝組織NF-κBp65、COX-2和iNOS的mRNA相對(duì)含量和蛋白表達(dá)水平顯著降低，炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相對(duì)含量也有不同程度下降。此結(jié)果表明DCP可通過(guò)抑制NF-κBp65蛋白表達(dá)，減少下游炎癥因子的釋放而發(fā)揮抗炎作用。

TGF-β1是一種多效細(xì)胞因子(促纖維化和炎癥因子)，參與免疫反應(yīng)和肝纖維化的發(fā)展。TGF-β1可導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(HSCs)的活化、增殖和纖維化過(guò)程[17]。α-SMA可反映HSC的活化情況，作為HSC激活的標(biāo)志性蛋白，同時(shí)也可用于評(píng)估肝纖維化程度。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是細(xì)胞外基質(zhì)降解和重構(gòu)的關(guān)鍵因素。MMP9是降解正常肝基質(zhì)最相關(guān)的MMPs之一，可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[18]。Western Blot分析顯示，模型組大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA和MMP9的蛋白表達(dá)水平顯著提高；相較于模型組，DCP低中高劑量各組大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA和MMP9的蛋白表達(dá)水平顯著降低。此結(jié)果表明DCP可通過(guò)減少CCl4引起的肝組織TGF-β1和MMP9蛋白表達(dá)，減緩肝臟內(nèi)膠原沉積的速度，從而起到緩解HF的作用。

LIN28A基因可以通過(guò)其獨(dú)特的冷休克結(jié)構(gòu)域(CSD)和半胱氨酸半胱氨酸組氨酸半胱氨酸鋅指節(jié)結(jié)構(gòu)域的配對(duì)被識(shí)別，在序列特異性mRNA結(jié)合、miRNA結(jié)合、miRNA前處理以及miRNA調(diào)控基因沉默中起著重要的作用[19]。已有研究證明LIN28A通過(guò)NF-κBp65信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)[19]，并且降低NF-κBp65的表達(dá)有助于緩解HF。在實(shí)驗(yàn)中，相較于正常組，模型組大鼠肝臟中LIN28A和NF-κBp65的蛋白表達(dá)水平和mRNA相對(duì)含量顯著提高，且DCP低中高劑量各組大鼠肝組織中LIN28A和NF-κBp65的蛋白表達(dá)水平和mRNA相對(duì)含量顯著降低且呈現(xiàn)出濃度依賴性。以上結(jié)果表明HF炎癥產(chǎn)生的過(guò)程可能與LIN28A的激活有關(guān)，結(jié)合DCP可以抑制LIN28A和NF-κBp65的表達(dá)，并抑制NF-κBp65下游COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的表達(dá)，推測(cè)DCP抗炎和治療HF的機(jī)制可能與通過(guò)抑制LIN28A/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，DCP對(duì)大鼠HF具有明顯改善作用，其藥效作用機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控LIN28A/NF-κB信號(hào)通路，阻止炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。