陳煥庭 賀德

盡管越來(lái)越多的研究關(guān)注胃癌治療的新策略，近年來(lái)胃癌發(fā)病率也逐步下降，但由于缺乏有效的治療策略和預(yù)后標(biāo)志物，胃癌患者的治療和預(yù)后仍不樂(lè)觀。通過(guò)檢測(cè)生物標(biāo)志物表達(dá)高低預(yù)測(cè)患者預(yù)后，對(duì)預(yù)后不良的患者進(jìn)行更頻繁的復(fù)查隨訪，及時(shí)發(fā)現(xiàn)不良征兆并進(jìn)行干預(yù)，以提高患者的存活率。過(guò)去幾十年里，新型治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和新型靶向藥物的開發(fā)已大大改變了抗腫瘤戰(zhàn)場(chǎng)的局面。因此，探索新的有效的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后，尋找新的治療靶點(diǎn)對(duì)改善胃癌患者的預(yù)后極為重要。

1 臨床資料

1.1 基因芯片與差異基因篩選 在NCBI-GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出包含胃癌組織和正常組織基因表達(dá)譜的芯片GSE19826、GSE54129、GSE79973，所篩選的芯片均來(lái)自GPL570 檢測(cè)平臺(tái)，用GEO2R 工具檢測(cè)胃癌和正常對(duì)照中的差異表達(dá)基因（DEGs），篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|logFC|＞2 和調(diào)整P 值＜0.05，再繪制韋恩圖選出3 個(gè)芯片中共同在胃癌組織中高表達(dá)的基因。

1.2 基因表達(dá)分析及生存分析 通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer-pku.cn/）篩選胃癌高表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析。借助Kaplan-Mei?er Plotter（www.kmplot.com）數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌臨床資料分析基因表達(dá)與胃癌患者總生存期的相關(guān)性。

1.3 功能及富集分析 通過(guò)HCMBD（Human Cancer Metastasis Database）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)胃癌中每個(gè)上調(diào)的基因進(jìn)行功能分析。通過(guò)Metascape（http：//metascape.org）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各個(gè)上調(diào)的基因進(jìn)行基因本體（細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程）和通路富集的分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖像繪制及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；基因表達(dá)與胃癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)。采用Ka?plan-Meier 法繪制生存曲線，并進(jìn)行Log-rank 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌中高表達(dá)基因篩選 篩選出基因芯片中胃癌組織相對(duì)正常胃組織上調(diào)和下調(diào)的基因，再通過(guò)繪制韋恩圖篩選出在這三張芯片中均上調(diào)（圖1A）和下調(diào)的（圖1B）基因的。其中，26 個(gè)高表達(dá) 的 基 因 是ADAMTS2、ASPN、BGN、CEMIP、COL1A1、COL1A2、COL6A3、COL8A1、COL10A1、COL11A1、CST1、CTHRC1、FAP、FNDC1、IGF2BP3、INHBA、MFAP2、PDLIM7、RARRES1、SFRP4、SPP1、SULF1、THBS2、THY1、TIMP1、WISP1。

圖1 通過(guò)韋恩圖篩選出三張基因芯片胃癌中均高表達(dá)的基因（圖A）和低表達(dá)的基因（圖B）

2.2 高表達(dá)基因在胃癌中再分析 通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步驗(yàn)證這26 個(gè)上調(diào)的基因在胃癌組織和正常胃組織中的mRNA 水平表達(dá)?？紤]胃腺癌是胃癌中最常見的病理類型，我們選擇胃腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如圖2 所示，這26 個(gè)基因除FDLIM7 外，其余25 個(gè)基因在胃癌中高表達(dá)。進(jìn)一步我們分析了基因隨著胃癌疾病進(jìn)展的表達(dá)變化。其中有22 個(gè)隨著胃癌疾病進(jìn)展表達(dá)逐漸升高的基因（ASPN、BGN、CEMIP、COL1A1、COL1A2、COL6A3、COL8A1、COL10A1、COL11A1、CTHRC1、FAP、FNDC1、INHBA、MFAP2、RARRES1、SFRP4、SPP1、SULF1、THBS2、THY1、TIMP1、WISP1）。

2.3 胃癌中高表達(dá)基因的預(yù)后價(jià)值 在Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中繪制生存曲線評(píng)估這26 個(gè)基因的mRNA 表達(dá)高低與胃癌患者總生存的相關(guān)性。如圖4 所示，23 個(gè)基因的表達(dá)與OS 呈顯著負(fù)相關(guān)，這23 個(gè)基因?yàn)锳DAMTS2、ASPN、BGN、CE?MIP、 COL1A1、 COL1A2、 COL6A3、 COL8A1、COL10A1、COL11A1、CST1、CTHRC1、FNDC1、IGF2BP3、INHBA、MFAP2、RARRES1、SFRP4、SULF1、THBS2、THY1、TIMP1、WISP1。 FAP 和SPP1 的表達(dá)與胃癌總生存無(wú)相關(guān)性。

2.4 胃癌中高表達(dá)基因的功能分析 接著，我們通過(guò)HCMBD（Human Cancer Metastasis Database）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了26 個(gè)胃癌中上調(diào)基因的功能。其中與腫瘤相關(guān)基因有BGN、CTHRC1、INHBA、TH?BS2、THY1、TIMP1、WISP1。BGN 編碼的蛋白可調(diào)節(jié)炎癥和先天免疫功能。CTHRC1 編碼的蛋白參與血管重塑，該基因位點(diǎn)突變與Barrett 食管和食管腺癌相關(guān)。INHBA 表達(dá)升高可能與人類患者的癌癥惡病質(zhì)有關(guān)。THBS2 編碼的蛋白介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，并參與細(xì)胞粘附和遷移。THY1 編碼的蛋白參與許多細(xì)胞黏附和通訊的生理活動(dòng)，該基因可能在鼻咽癌中起抑癌作用。TIMP1 編碼的蛋白是降解細(xì)胞外基質(zhì)的肽酶-基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）抑制劑。WISP1 可能位于WNT1 信號(hào)通路的下游。

圖2 26 個(gè)基因在胃癌組織和正常胃組織中的mRNA 水平表達(dá)

圖3 基因表達(dá)與胃癌患者的生存分析

此外，我們還借助Metascape 工具對(duì)這26 個(gè)基因進(jìn)行了功能富集分析。圖4 顯示了這26 個(gè)基因參與的生理過(guò)程，這些生理過(guò)程都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖4 胃癌中上調(diào)基因的功能富集分析

3 討 論

借助基因芯片挖掘有價(jià)值的基因表達(dá)信息，能夠在大量基因中快速識(shí)別不同組別之間差異表達(dá)基因，聯(lián)合生物信息學(xué)方法可以進(jìn)一步研究和深入挖掘。在本研究中，我們通過(guò)基因芯片和公共數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床資料篩選出23 個(gè)基因可作為胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。臨床上，如果胃癌患者具有高表達(dá)的這23 個(gè)基因，那么這部分患者可能預(yù)后較差。結(jié)合這23 個(gè)基因的功能，我們初步推測(cè)BGN、CTHRC1、INHBA、THBS2、THY1、TIMP1、WISP1 可以作為潛在的胃癌治療靶點(diǎn)。然而，這些結(jié)論還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，我們只關(guān)注這些基因的mRNA 水平而非蛋白水平的表達(dá)，也需要進(jìn)一步研究這些基因的蛋白表達(dá)水平和相應(yīng)的功能。我們目前的結(jié)果為后續(xù)更深入的基礎(chǔ)研究提供重要方向和信息。

既往研究顯示這7 個(gè)基因與胃癌發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。例如，BGN 是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，在多種腫瘤中發(fā)揮作用，在胃癌中過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［1］。CTHRC1 在多種惡性細(xì)胞中表達(dá)，胃癌中過(guò)表達(dá)通過(guò)激活HIF1α/CXCR4 信號(hào)通路顯著提高細(xì)胞遷移和侵襲能力［2］。INHBA基因沉默會(huì)抑制TGF-β 信號(hào)通路的激活，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并通過(guò)小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該研究作者認(rèn)為INHBA 是胃癌潛在的治療靶點(diǎn)［3］。沉默THBS2 基因可以通過(guò)PI3K-Akt 信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡［4］。THY1 介導(dǎo)Notch 信號(hào)通路可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移［5］。TIMP1 在小鼠和人胃癌細(xì)胞中通過(guò)NF-κB 依賴機(jī)制過(guò)表達(dá)并促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)［6］。WISP1 在多種人類惡性腫瘤中上調(diào)，并與疾病進(jìn)展相關(guān)。在胃癌中，WISP1 表達(dá)顯著上調(diào)與腫瘤進(jìn)展、化療結(jié)果和預(yù)后相關(guān)［7］。因此，我們認(rèn)為這幾個(gè)基因有潛力成為預(yù)測(cè)胃癌總生存的生物標(biāo)志物。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)7 個(gè)基因有希望成為胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)論可為胃癌患者的預(yù)后提供參考意見，以此開發(fā)新的胃癌靶向治療藥物，提高胃癌患者整體生存率和改善患者預(yù)后，具有一定的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。也為探討胃癌的分子調(diào)控機(jī)制也提供了一定的實(shí)驗(yàn)方向。