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        AcrAB-TolC外排泵在多重耐藥腸桿菌中的作用研究進(jìn)展

        2021-04-06 14:05:27華煒聰鄧在春張?bào)?/span>朱丹萍陳眾博
        中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2021年4期

        華煒聰 鄧在春 張?bào)蕖≈斓て肌£惐姴?/p>

        [摘要] 耐多藥腸桿菌的出現(xiàn)嚴(yán)重威脅著人類健康。AcrAB-TolC外排泵的過(guò)量表達(dá)是引起腸桿菌多重耐藥的主要機(jī)制之一,其主要由周質(zhì)融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB構(gòu)成,受整體調(diào)控因子、局部調(diào)控因子以及環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)等調(diào)節(jié)。對(duì)AcrAB-TolC外排泵的研究,不僅有助于闡明相關(guān)耐藥本質(zhì),還有助于研制有臨床意義的外排泵抑制劑(EPIs),為解決腸桿菌多重耐藥問(wèn)題提供新思路。本文對(duì)AcrAB-TolC外排泵的結(jié)構(gòu)、調(diào)控等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

        [關(guān)鍵詞] AcrAB-TolC;外排泵;腸桿菌;多重耐藥

        [中圖分類號(hào)] R378.2 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701(2021)04-0184-05

        Research progress of AcrAB-TolC efflux pump in multidrug resistant enterobacteria

        HUA Weicong1 ? DENG Zaichun1, 2 ? ZHANG Yun2 ? ZHU Danping2 ? CHEN Zhongbo1, 2

        1.Ningbo University School of Medicine, Ningbo ? 315020, China; 2.Department of Respiratory Medicine, the Affiliated Hospital of Medical School of Ningbo University, Ningbo ? 315020, China

        [Abstract] The emergence of multidrug-resistant enterobacteria poses a serious threat to human health. Overexpression of AcrAB-TolC efflux pump is one of the main mechanisms that causes multidrug resistance in enterobacteria. It is mainly composed of periplasmic fusion protein AcrA, outer membrane channel protein TolC and drug proton transporter AcrB, and is regulated by global regulatory factors, local regulatory factors and chemicals in the environment. The study of AcrAB-TolC efflux pump is not only helpful to clarify the nature of drug resistance, but also helpful to develop clinically significant efflux pump inhibitors(EPIs), providing new ideas for solving the problem of multiple drug resistant enterobacteria. This article makes a review on the research progress of the structure and regulation of AcrAB-TolC efflux pump.

        [Key words] AcrAB-TolC; Efflux pump; Enterobacteria; Multidrug resistance

        隨著抗生素使用的日益增多,細(xì)菌多重耐藥問(wèn)題已成為全球公共衛(wèi)生危機(jī)[1-2]。多重耐藥是指細(xì)菌對(duì)三種及以上的抗生素同時(shí)耐藥。目前臨床觀察到的重癥細(xì)菌感染中,多重耐藥的腸桿菌較多。藥物外排泵是腸桿菌產(chǎn)生多重耐藥的主要機(jī)制之一[1,3],其化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)??股鼗蛴卸净衔锎嬖跁r(shí),外排作用可能是腸桿菌應(yīng)激反應(yīng)中最快和最有效的抵抗機(jī)制[3]。革蘭陰性桿菌中最具臨床意義的外排泵是耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化(Resistance nodulation-cell division,RND)家族的成員,能識(shí)別廣泛的底物,與多重耐藥相關(guān)。這些外排泵以三聚體方式存在,橫跨細(xì)菌內(nèi)外膜;其中,AcrAB-TolC系統(tǒng)是最經(jīng)典的RND家族,多存在于腸桿菌科細(xì)菌[4]。腸桿菌中存在許多膜孔蛋白,可以根據(jù)分子的大小、形狀和電荷等選擇性地允許分子(包括抗生素)被動(dòng)擴(kuò)散[5]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度聚集達(dá)到一定數(shù)值時(shí),AcrAB-TolC外排泵以質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力為能力將其泵出,從而增強(qiáng)了細(xì)菌在不良環(huán)境中的生存能力。因此,細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度也是藥物流入和流出之間的平衡點(diǎn)。AcrAB-TolC系統(tǒng)可能在細(xì)菌耐藥質(zhì)粒傳播方面有一定的推動(dòng)作用[6]。此外,其也是大多腸桿菌毒力和生物膜形成所必需的[7-8]。對(duì)部分細(xì)菌來(lái)說(shuō),該泵表達(dá)水平?jīng)Q定多重耐藥表型,泵失活則菌株可從多重耐藥變回敏感。所以,進(jìn)一步研究AcrAB-TolC泵對(duì)臨床具有重要意義。若能研制出有臨床價(jià)值的外排泵抑制劑,將極大幫助臨床醫(yī)生的用藥,恢復(fù)現(xiàn)有抗生素的臨床療效,降低多重耐藥細(xì)菌感染所致的死亡率,是細(xì)菌多重耐藥問(wèn)題上的重大突破。

        1 AcrAB-TolC外排泵的結(jié)構(gòu)

        1.1 AcrAB-TolC外排泵結(jié)構(gòu)蛋白的組成

        AcrAB-TolC外排泵主要由周質(zhì)融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子 AcrB構(gòu)成。外排功能的實(shí)現(xiàn)需要三者共同參與,缺一不可。否則,即使存在其他能夠增強(qiáng)外排泵功能的機(jī)制,細(xì)菌仍然不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。不過(guò),Saw等[9]的實(shí)驗(yàn)側(cè)面印證了Doumith等實(shí)驗(yàn)結(jié)論“在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌分離株中acrB mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)沒(méi)有增加”,說(shuō)明AcrAB-TolC系統(tǒng)可能并不是腸桿菌必需的耐藥機(jī)制。

        AcrA、AcrB和TolC蛋白以三聚體的形式存在。其中AcrA蛋白被認(rèn)為在膜融合中起到了一定作用,其位于周質(zhì)間隙中,其C端肽鏈連接著內(nèi)膜上AcrB,N端肽鏈則在C端的協(xié)助下與外膜通道蛋白TolC相互作用[10]。AcrA近膜端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化對(duì)AcrAB- TolC的組裝至關(guān)重要,可以作為開發(fā)新型泵抑制劑的靶點(diǎn)[11]。AcrA蛋白缺失時(shí),可由其同源周質(zhì)融合蛋白AcrE補(bǔ)充,兩者同源性為68.5%,功能相似。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明,若要以周質(zhì)融合蛋白為泵抑制劑的藥物靶點(diǎn),必須同時(shí)作用于AcrA和AcrE蛋白才有效[12]。AcrB蛋白位于細(xì)胞內(nèi)膜,其能捕獲來(lái)自細(xì)胞周質(zhì)的物質(zhì),并將有害的物質(zhì)排出細(xì)胞,稱為細(xì)菌的“吸塵器”[13]。有研究發(fā)現(xiàn),AcrB蛋白缺失后,與其同源的RND外排泵系統(tǒng)如AcrD、AcrF蛋白會(huì)代償性產(chǎn)生,這樣既可以保證細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整,又能維持外排功能[14]。但若AcrB蛋白只是處于失活狀態(tài),則不會(huì)發(fā)生以上蛋白的代償性生成。不過(guò),AcrD和AcrF蛋白的生成水平低至無(wú)法檢測(cè),這意味著實(shí)際上,AcrD和AcrF蛋白無(wú)法補(bǔ)救AcrB蛋白缺失致外排功能喪失后所帶來(lái)的影響[5]。TolC蛋白位于細(xì)胞外膜,為排出的藥物和毒素提供了一條穿越細(xì)菌外膜的途徑。有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌細(xì)胞的藥敏性與TolC變異體的濃度變化不相匹配。無(wú)論實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的TolC蛋白濃度低于還是高于對(duì)照組的TolC蛋白濃度(濃度相差至少10倍),大部分常用抗生素的MIC仍保持不變,說(shuō)明即使將TolC蛋白抑制到極低濃度,也無(wú)法限制外排泵的藥物外排能力,從中可推測(cè)只有一小部分TolC蛋白參與外排作用[15]。所以對(duì)新藥研發(fā)來(lái)說(shuō),TolC蛋白并不是抑制多藥外排的良好靶點(diǎn)。

        1.2 AcrAB-TolC外排泵的作用過(guò)程

        革蘭陰性桿菌由于有雙膜結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)外排途徑較復(fù)雜。Shi等[16]認(rèn)為,AcrA-TolC泵的開啟和抗生素的泵出是一個(gè)短暫的過(guò)程,大部分時(shí)間組件均處于封閉狀態(tài),而不是活躍狀態(tài)。通過(guò)斷層掃描數(shù)據(jù)進(jìn)一步揭示AcrAB-TolC外排泵的組裝順序。首先,AcrB與AcrA蛋白結(jié)合形成二聚體AcrAB。然后,AcrA改變構(gòu)象以嵌合TolC。一旦TolC與AcrAB二聚體結(jié)合,組裝完全的外排泵保持靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)AcrB遇到藥物分子時(shí),該泵開放通道,沿通道長(zhǎng)軸收縮,使底物(藥物)通過(guò)通道排出細(xì)胞,待底物排出后立即關(guān)閉[13,17]。不同于尋常那些狹小、緊密貼合的結(jié)合位點(diǎn),AcrAB-TolC外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合藥物分子的位點(diǎn)通常較寬大,以允許用更少的自由能去容納更多的底物[18]。AcrAB-TolC外排泵大多為非特異性的,可以排出多種不同作用機(jī)制和不同作用位點(diǎn)的抗生素,但也有少數(shù)是特異性的,如四環(huán)素外排泵。

        2 AcrAB-TolC外排泵的調(diào)控因子

        AcrAB-TolC外排泵的調(diào)控分為整體調(diào)控和局部調(diào)控兩種,整體調(diào)控因子有MarA、RamA、Rob、SoxS等,局部調(diào)控因子主要有AcrR,本文主要對(duì)整體正調(diào)控因子MarA和RamA及局部負(fù)調(diào)控因子AcrR作一綜述。

        2.1 MarA蛋白對(duì)AcrAB-TolC外排泵的正向調(diào)節(jié)

        MarA蛋白是一種整體轉(zhuǎn)錄激活子,增加AcrAB-TolC泵的外排作用,屬于AraC/XylS家族蛋白的成員。在操縱子mar家族中,除marA外,參與多重耐藥機(jī)制的還有marR、marB。marA基因雖然總是被MarR抑制,但其編碼的MarA蛋白能夠與marR基因阻遏位點(diǎn)上游的DNA序列(即marbox)結(jié)合以發(fā)揮正反饋?zhàn)饔?,從而抑制marR基因并激活marA基因。MarR蛋白除了可以抑制acrAB基因表達(dá),在沒(méi)有任何環(huán)境信號(hào)影響時(shí),也可阻止自身轉(zhuǎn)錄。marB基因可增加marA基因的表達(dá)水平,在轉(zhuǎn)錄后起作用,具體機(jī)制不明[19]。

        至今,仍有不少學(xué)者認(rèn)為,Mar突變體僅僅是通過(guò)促使AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)過(guò)度表達(dá)而引起多重耐藥。其實(shí)不然,mar系統(tǒng)對(duì)其他基因也有調(diào)節(jié)作用,有些還參與了對(duì)特定藥物的耐藥機(jī)制。Sharma等[20]通過(guò)實(shí)驗(yàn)鑒定了33個(gè)受MarA蛋白調(diào)控的靶基因,發(fā)現(xiàn)除acrAB和tolC基因外,MarA蛋白還能上調(diào)在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA損傷修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用的基因,從而減少抗生素滲入和DNA損傷。

        2.2 RamA蛋白對(duì)AcrAB-TolC外排泵的正向調(diào)節(jié)

        RamA蛋白是MarA蛋白的同系物,也屬于AraC/XylS家族。與MarA一樣,RamA通過(guò)直接結(jié)合acrAB和tolC基因位點(diǎn)上游的退化核苷酸序列(即rambox)而激活acrAB和tolC[5]。ramR基因位于ramA的上游,其能抑制ramA的轉(zhuǎn)錄,同樣,RamA蛋白也能抑制RamR蛋白的結(jié)合。當(dāng)ramR基因缺失或失活時(shí),RamA蛋白則會(huì)過(guò)量表達(dá),引起多重耐藥[21-23]。多數(shù)AcrAB-TolC外排泵的底物無(wú)法誘導(dǎo)RamA蛋白的表達(dá),而當(dāng)AcrB蛋白失活后,RamA可呈四倍速增長(zhǎng)。當(dāng)AcrAB-TolC泵部分失活或加入外排泵抑制劑時(shí),RamA的表達(dá)量明顯升高[19,24]。沙門氏菌在RamA蛋白缺失的情況下,篩選出MDR突變體很困難,這意味著,RamA在沙門菌多重耐藥機(jī)制中是主要的調(diào)控因子[25]。不過(guò)少數(shù)腸桿菌中不存在RamA蛋白,如大腸埃希菌。

        氯丙嗪能以濃度依賴的方式誘導(dǎo)RamA蛋白,Ricci等[26]先通過(guò)氯丙嗪誘導(dǎo)RamA蛋白過(guò)量表達(dá),再去除氯丙嗪,發(fā)現(xiàn)RamA蛋白的量立刻恢復(fù)至誘導(dǎo)前的水平,推測(cè)過(guò)高水平的RamA蛋白或過(guò)量的AcrAB-TolC系統(tǒng)可能對(duì)細(xì)菌有害,且認(rèn)為有另一種調(diào)節(jié)機(jī)制在維持平衡。外排泵的高能量需求是其不過(guò)度表達(dá)的可能因素。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,RamA蛋白的量能夠恢復(fù)到誘導(dǎo)前的水平是通過(guò)Lon蛋白酶的調(diào)節(jié)。該酶可以水解RamA、MarA蛋白等,若Lon突變可導(dǎo)致AcrAB蛋白和多重耐藥的增加[19]。

        2.3 AcrR蛋白對(duì)AcrAB-TolC外排泵的負(fù)向調(diào)控

        局部調(diào)控因子AcrR抑制acrAB基因的過(guò)表達(dá)[27]。acrR基因位于acrAB操縱子的上游,與acrAB基因轉(zhuǎn)錄方向相反。AcrR蛋白N端存在DNA結(jié)合的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)基序,C端存在特異性配體結(jié)合序列。毒性化合物能與AcrR蛋白的C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合,引起其N端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變,AcrR蛋白從DNA中釋放,使靶基因(即acrAB基因)得以轉(zhuǎn)錄[28]。反之,AcrR蛋白再與acrAB基因調(diào)控區(qū)特異性結(jié)合發(fā)揮泵抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn),AcrR蛋白缺失除了增加耐藥性,還可提高細(xì)菌的活性、黏附、毒力,促進(jìn)生物膜的形成等[27]。同MarR蛋白一樣,AcrR蛋白也能抑制自身的合成。

        3 環(huán)境因素對(duì)外排泵的調(diào)控作用

        大量環(huán)境因素也能調(diào)控外排泵系統(tǒng)。腸桿菌大多存在于宿主消化道中,常與膽汁、脂肪酸和陽(yáng)離子肽等環(huán)境誘導(dǎo)因子接觸,這些環(huán)境誘導(dǎo)因子與Rob蛋白結(jié)合從而誘導(dǎo)AcrAB蛋白過(guò)表達(dá),以助腸桿菌生存[19]。Urdaneta等[29]實(shí)驗(yàn)證明,亞致死濃度的膽鹽誘導(dǎo)acrAB基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào),對(duì)腸桿菌早期適應(yīng)宿主環(huán)境至關(guān)重要。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在缺少單個(gè)或多個(gè)外排泵系統(tǒng)的沙門氏菌突變體中,只有AcrAB蛋白缺失的突變體無(wú)法在亞致死濃度的膽鹽環(huán)境下生長(zhǎng),揭示了AcrAB蛋白對(duì)細(xì)菌膽汁耐受的重要性。另有研究證實(shí),大量環(huán)境刺激可以增加ramA基因的表達(dá)以激活A(yù)crAB蛋白,如細(xì)菌代謝產(chǎn)物吲哚[30]、苯噻嗪、血清素?cái)z取抑制劑、氯丙嗪等抗精神藥物、生物殺菌劑、某些抗生素和溫度[24]。

        4 藥物治療后的細(xì)菌外排作用可能更強(qiáng)

        Adler等[31]將大腸埃希菌暴露于美羅培南或厄他培南中進(jìn)行60次傳代,通過(guò)基因組測(cè)序后發(fā)現(xiàn),AcrAB-TolC介導(dǎo)的外排作用較前增強(qiáng)。不止體外研究結(jié)果如此,臨床中亦有文獻(xiàn)報(bào)道,來(lái)源于同一患者的沙門氏菌,抗感染治療失敗后的菌株較治療前的菌株外排泵功能更強(qiáng),AcrB蛋白的表達(dá)更多。Blair等[32]進(jìn)一步對(duì)AcrB蛋白基因測(cè)序發(fā)現(xiàn),藥物誘導(dǎo)株中甘氨酸替代了第288位的天門冬氨酸,推測(cè)該突變使AcrB蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。雖然這不能代表此種突變的菌株對(duì)所有抗生素的外排功能都增強(qiáng),但也提示不合理的抗感染治療可能會(huì)加重耐藥問(wèn)題。

        5 外排泵抑制劑的研發(fā)意義

        在新型藥物的研制中,外排泵是一個(gè)有潛力的突破點(diǎn)[33]。經(jīng)典的抗耐藥菌藥物β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,雖在臨床上應(yīng)用價(jià)值很大,但只針對(duì)于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌。而外排泵抑制劑(Efflux pump inhibitors,EPIs)可能同時(shí)增加多種細(xì)菌對(duì)多種抗生素的敏感性,這是因?yàn)橥馀疟媒^大多數(shù)是非特異性的,廣泛存在于各種生物體中。EPIs還可以減少細(xì)菌篩選耐藥突變體的機(jī)會(huì)[34]。有實(shí)驗(yàn)[8]證明,EPIs具有阻止藥物排出和干擾生物膜形成的能力,從而增強(qiáng)抗生素作用,逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性。理想的EPIs能夠抑制存在于各種病原體且來(lái)自不同家族的外排泵,但這極具挑戰(zhàn)性。因此,針對(duì)特定的外排泵家族來(lái)設(shè)計(jì)窄譜EPIs可能是最佳的選擇。不過(guò),有臨床價(jià)值的EPIs除了能有效抑制外排泵的功能,還需滿足毒性低、與抗生素具有協(xié)同作用、不對(duì)缺乏外排泵的敏感菌株產(chǎn)生影響等條件。

        EPIs可通過(guò)干擾外排泵的表達(dá)和組裝、阻斷能量來(lái)源、阻礙底物通過(guò)外排通道等機(jī)制發(fā)揮作用。最早研發(fā)的可以對(duì)抗革蘭陰性菌中RND家族泵的抑制劑是PAβN(Phe-Arg-β-naphthylamide,又稱MC-207110),其機(jī)制是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合外排泵相應(yīng)位點(diǎn)以阻止其他底物與該位點(diǎn)的結(jié)合,但因毒性問(wèn)題和低穩(wěn)定性限制了其臨床的應(yīng)用[7],與其相同機(jī)制的還有喹啉衍生物、MBX2319[34]等;CsrA可以作為抑制劑,使acrAB基因轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定,影響AcrAB-TolC系統(tǒng)的功能[5];反義技術(shù)如肽結(jié)合磷酸二胺酯嗎啡低聚物(PPMOs)可以抑制外排泵的表達(dá),可能對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類或氟喹諾酮類藥物的治療有利[35];預(yù)設(shè)計(jì)錨蛋白重復(fù)蛋白(Designed ankyrin repeat proteins,DARPins)可抑制AcrA和AcrB蛋白的相互作用[11];羰基氰間氯苯腙(CCCP)主要通過(guò)阻斷外排泵的能量來(lái)源發(fā)揮抗耐藥作用[36];還有一些偶然發(fā)現(xiàn)的天然EPIs,如糖槭中提取的富酚楓糖漿提取物[34],目前機(jī)制不明。此外,已在臨床上應(yīng)用的藥物也是EPIs的來(lái)源。其中,抗癌藥物有望成為EPIs的候選藥物。因細(xì)菌細(xì)胞和癌細(xì)胞均能產(chǎn)生對(duì)有毒化合物的抗性,而這種抗性通常是由于外排泵的過(guò)表達(dá)造成的[37]。盡管發(fā)現(xiàn)了大量潛在的外排泵抑制劑,不幸的是,尚沒(méi)有一種被批準(zhǔn)用于臨床[38],故EPIs的研發(fā)工作仍任重而道遠(yuǎn)。

        需要注意的是外排泵抑制劑不能濫用。Saw等[9]發(fā)現(xiàn),加入外排泵抑制劑PAβN反而會(huì)增加細(xì)菌對(duì)某些抗生素的耐藥。所以今后臨床上對(duì)外排泵抑制劑的合理應(yīng)用十分重要,應(yīng)仔細(xì)評(píng)估后再選擇,以確保不會(huì)適得其反。

        腸桿菌為適應(yīng)不良環(huán)境,通過(guò)外排泵以排出有毒物質(zhì)或代謝產(chǎn)物,形成多重耐藥現(xiàn)象。盡管臨床上可使用的抗菌藥物有數(shù)百種,但針對(duì)多重耐藥甚至全耐藥菌,仍常面臨著無(wú)藥可用的境地,且這種情況隨著抗菌藥物的廣泛使用愈發(fā)常見(jiàn)。眾所周知,一款新型抗菌藥物的研制及推廣需要花費(fèi)的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)是龐大的。如果換種思路,將研究放在泵抑制劑的研發(fā)上,輔助現(xiàn)有抗生素的抗菌作用,可以恢復(fù)多種抗菌藥物的臨床療效,也極大節(jié)省了緊張的醫(yī)療資源。盡管對(duì)AcrAB-TolC系統(tǒng)已進(jìn)行不少的研究,但有價(jià)值的臨床應(yīng)用尚未發(fā)現(xiàn),故仍需要更多的深入研究。

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        (收稿日期:2020-03-02)

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