馮煒業(yè) 柯璐琳

慢性膽囊炎為相當(dāng)常見的消化系統(tǒng)疾病，多由膽結(jié)石所致膽囊壁炎癥，或膽汁瘀積、感染導(dǎo)致急性膽囊炎反復(fù)發(fā)作拖延不愈而致[1]。這幾年，中醫(yī)藥在醫(yī)治慢性膽囊炎上發(fā)揮了重要作用，在一定程度上補充了西藥治療療效不佳的情況。

膽舒膠囊中主要活性成分為薄荷素油，其為新鮮的唇形科薄荷的莖和葉經(jīng)一系列加工獲得的揮發(fā)油。薄荷是傳統(tǒng)的食藥兩用植物，具有抑菌、抗炎、止痛、抗癌、解痙等生物活性，臨床上可將其為單方或復(fù)方治療慢性膽囊炎，但在薄荷治療慢性膽囊炎的分子機制上的研究報道甚少。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出膽舒膠囊中君藥薄荷的主要有效活性成分和發(fā)揮作用的靶點，探究慢性膽囊炎的已知疾病靶點，分別繪制PPI及“薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，并進行分析；依托Bioconductor數(shù)據(jù)庫，運用R語言軟件及clusterProfiler等數(shù)據(jù)包對靶點基因本體(GO)的生物進程(BP)、分子功能(MF)、細胞成分(CC)3個水平及KEGG信號通路進行分析，為膽舒膠囊治療慢性膽囊炎分子機制的進一步探索提供參考。

1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)分析平臺；Pubchem數(shù)據(jù)庫；Swiss target predict數(shù)據(jù)庫；GeneCards數(shù)據(jù)庫；OMIM數(shù)據(jù)庫；Uniprot數(shù)據(jù)庫；String數(shù)據(jù)庫； Venny 2.1.0軟件； Cytoscape 3.7.2軟件；Bioconductor數(shù)據(jù)庫；R語言軟件；clusterProfiler等數(shù)據(jù)包等。

2 方法

2.1 主要活性成分及作用靶點的篩選基于TCMSP平臺，“薄荷”為關(guān)鍵詞，選擇口服生物利用度(OB)≥30%并且類藥特性(DL)≥0.18作為篩選條件[2]，同時結(jié)合楊倩[3]的報道，獲得相關(guān)的化合物成分。將篩選后的化學(xué)成分導(dǎo)入Pubchem服務(wù)器，得到化學(xué)成分2D結(jié)構(gòu)的SDF文件。最后，運用Swiss target predict數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入化學(xué)成分的SDF文件，選擇物種為“智人”，選擇Probability值>0的靶點，剔除未獲得靶點的成分，剔除重復(fù)靶點，獲取活性成分靶基因，并經(jīng)過Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫對靶基因進行注釋。

2.2 疾病靶點的收集分別在GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫、以“chronic cholecystitis”為關(guān)鍵詞，搜集與慢性膽囊炎發(fā)病的相關(guān)靶基因，合并2個數(shù)據(jù)庫疾病靶點，剔除重復(fù)值，獲得慢性膽囊炎疾病靶點。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的繪制與分析運用 Venny 2.1.0軟件將薄荷活性成分靶點與慢性膽囊炎疾病靶點進行交集，得到膽舒膠囊醫(yī)治慢性膽囊炎的治療靶點。將獲得的治療靶點上傳String在線數(shù)據(jù)庫，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)圖中的核心基因進行分析。

2.4 “薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將薄荷、有效活性成分、交集治療靶點、疾病間相互關(guān)系導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 GO與KEGG富集分析依托Bioconductor數(shù)據(jù)庫，R語言軟件及clusterProfiler等數(shù)據(jù)包對膽舒膠囊治療靶點的生物進程、分子功能、細胞成分3個水平進行GO富集分析；同樣方法進行KEGG富集分析，R語言繪制KEGG信號通路富集分析高級氣泡圖，以揭示膽舒膠囊治療慢性膽囊炎的分子機制。

3 結(jié)果

3.1 藥物靶點及疾病靶點的確定TSMCP平臺檢索得到薄荷化學(xué)成分有164個，符合篩選條件的化學(xué)成分10個，分別為金柑苷、金合歡素、蒙花苷、豆甾醇、谷甾醇、柚皮素、蘆薈大黃素、圣草酚、芫花素、木犀草素；結(jié)合文獻報道薄荷揮發(fā)油含量高的4個活性成分，分別是L-薄荷酮、胡椒酮、L-薄荷醇、胡薄荷酮；在Swiss target predict數(shù)據(jù)庫剔除未獲得成分對應(yīng)靶點的蘆薈大黃素以及未與疾病靶點獲得交集的胡薄荷酮，篩選出薄荷化學(xué)成分12個，薄荷作用靶點270個，見表1。經(jīng)過GeneCards與OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，整合獲得慢性膽囊炎疾病靶點502個，運用Venny 2.1.0軟件取薄荷與慢性膽囊炎疾病靶點交集，見圖1。得到治療靶點36個，見表2。

表1 薄荷關(guān)鍵化合物

圖1 韋恩圖

表2 薄荷治療慢性膽囊炎的關(guān)鍵靶點

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)將治療靶點上傳String數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“智人”，選擇medium confidence(0.400)，隱藏離散點，得到靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。其中節(jié)點代表治療靶點，“邊”代表治療靶點之間的關(guān)聯(lián)，其粗細用結(jié)合分數(shù)表示，“邊”越粗結(jié)合分數(shù)值越大，代表其結(jié)合度越大。由R語言軟件繪制出節(jié)點數(shù)排名前20的核心基因條形圖，橫坐標(biāo)為節(jié)點數(shù)，縱坐標(biāo)為基因symbol。見圖3。

圖2 薄荷靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白互作核心基因柱狀圖

3.3 “薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建薄荷治療慢性膽囊炎的藥物-有效活性成分-交集治療靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，從而間接體現(xiàn)了膽舒膠囊治療慢性膽囊炎多組分、多靶點協(xié)同作用的特點。見圖4。

圖4 薄荷-有效活性成分-交集治療靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 GO富集分析采用UniProt數(shù)據(jù)庫對基因symbol進行ID轉(zhuǎn)換，依托Bioconductor數(shù)據(jù)庫，運用R語言軟件及clusterProfiler等數(shù)據(jù)包，設(shè)置pvalueCutoff與qvalueCutoff的值為0.05，從生物進程、分子功能、細胞成分3個水平對36個關(guān)鍵靶點進行分類富集分析，GO富集結(jié)果包括細胞對氧化的應(yīng)激反應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng)、正向調(diào)節(jié)平滑肌細胞的增殖、膠原代謝過程等生物進程；蛋白磷酸酶、絲氨酸水解酶活性、過氧化酶活性等分子功能；膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、肥大細胞顆粒等細胞成分。

3.5 KEGG富集分析利用上述的基因ID，同樣依托Bioconductor數(shù)據(jù)庫，利用R語言軟件及clusterProfiler等數(shù)據(jù)包，設(shè)置pvalueCutoff與qvalueCutoff的值為0.05進行KEGG信號通路分析，包括癌癥通路、TNF信號通路、Relaxin信號通路、磷酸酯酶D信號通路、VGEF信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路等代謝通路。取排名前20的KEGG信號通路繪制高級氣泡圖。見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析高級氣泡圖

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對藥物治療疾病的靶點、通路等可以從分子水平上預(yù)測，故本文通過該策略研討膽舒膠囊醫(yī)治慢性膽囊炎的分子機制，結(jié)果獲得12個主要活性成分，分別為金柑苷、金合歡素、蒙花苷、豆甾醇、谷甾醇、柚皮素、圣草酚、芫花素、木犀草素、L-薄荷酮、L-薄荷醇、胡椒酮?，F(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)金合歡素具備多重生物活性，如抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等效用[4]。蒙花苷可以通過調(diào)節(jié)炎性因子與炎性介質(zhì)的水平而產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用[5]。谷甾醇的抗炎機制可能是通過抑制炎癥介質(zhì)PGE2、緩激肽、組胺、5-HT等的活性來抑制游離細胞的遷移[6]。豆甾醇和圣草酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等藥理活性。L-薄荷酮、L-薄荷醇、胡椒酮為薄荷揮發(fā)油中含量高的主要成分，它們可通過干預(yù)消化道鈣離子的跨膜運動產(chǎn)生解痙、使消化道平滑肌松弛，形成利膽作用[7]。周露[8]的研究表明薄荷揮發(fā)油具有顯著的抗大腸埃希氏菌、嗜肉菌、白假絲酵母菌等菌株活性。

藥物與疾病的交集靶點36個，包括VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK3、PTGS2、MMP9、MMP2、MPO、HIF1A等，主要涉及血管生成、炎癥反應(yīng)、癌癥進展、細胞凋亡及氧化應(yīng)激等生理病理進程。在VEGFRA-VEGFR2信號蛋白通路中，PI3K下游信號的AKT激活后，通過下游的Bad、mTORC1、FOXO、GSK-3β、eNOS等靶分子調(diào)節(jié)細胞凋亡和血管通透性、參與血管生成和浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的炎癥反應(yīng)。表皮生長因子受體(EGFR)是影響局部上皮組織新生血管修復(fù)和內(nèi)皮細胞形成的重要因素，其可以參與癌癥、炎癥、免疫疾病的進展。EGFR是EGF與TGF-α受體；同時，相關(guān)研究表明，EGFR可導(dǎo)致膽固醇核化過程異常，促使膽結(jié)石的形成[9]。因此，我們推測，薄荷中的有效活性成分可與EGFR相互作用，阻斷促炎因子與EGFR結(jié)合，起到抗炎作用，同時抑制膽結(jié)石的形成。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一類可誘導(dǎo)細胞凋亡的因子，可由多種細胞分泌表達，其生物學(xué)功能主要包括細胞凋亡、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等。TNF-α細胞因子處于家族中最重要的地位，主要通過對MAPK、NF-κB、ERK等信號通路的上調(diào)，起誘導(dǎo)細胞凋亡和促炎作用[10]。MAPK靶點同樣與腫瘤、炎癥、氧化應(yīng)激密切相關(guān)[11]，磷酸化的p38MAPK可激活許多底物如轉(zhuǎn)錄因子、胞漿與胞核內(nèi)蛋白、蛋白激酶等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細胞的分化、周期停滯、衰老、凋亡、細胞因子的產(chǎn)生和RNA剪接的調(diào)控等，且這種活化作用通常具有組織細胞特異性。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS2)作為環(huán)氧酶途徑中的雙功能酶，作為前列腺素中氧化酶的還原酶，具備COX與過氧化酶活性，可將花生四烯酸催化成前列腺素，推測薄荷活性成分可能通過抑制PTGS2以達到抗炎、鎮(zhèn)痛效果。MMPs是肽鏈內(nèi)切酶，它能夠降解細胞外基(ECM)的組成成分，MMP9、MMP2可促成腫瘤新生血管的形成，導(dǎo)致血管局部基底膜降解，創(chuàng)造促進血管生成，促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[12]。髓系細胞中的髓過氧化物酶(MPO)遇到病原體后，骨髓細胞可以產(chǎn)生過量的H2O2，MPO與H2O2等氧化劑發(fā)生過氧化反應(yīng)和正鹵化反應(yīng)，產(chǎn)生殺菌能力很強的次氯酸(HClO)，可引起蛋白質(zhì)破裂、DNA變性和氨基酸分解等病理過程[13]。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)作為一種由機體在缺氧時產(chǎn)生的依賴氧的轉(zhuǎn)錄激活物,誘導(dǎo)VEGF、促炎黏附分子和趨化因子的表達，調(diào)節(jié)機體適應(yīng)缺氧環(huán)境。

經(jīng)過GO及KEGG富集結(jié)果分析可知，GO富集分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點參與細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、金屬離子的響應(yīng)、正向調(diào)節(jié)平滑肌細胞的增殖、膠原代謝過程等生物進程；蛋白磷酸酶、絲氨酸水解酶活性、過氧化酶活性等分子功能；膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、肥大細胞顆粒等細胞成分。KEGG富集分析提示膽舒膠囊主要是通過癌癥、TNF、Relaxin、磷酸酯酶D、VEGF、HIF-1等信號通路發(fā)揮協(xié)同作用。HIF-1通路水平的變化與AKT，NF-κB通路有關(guān)，還可誘導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄，為干預(yù)炎癥損傷、氧化應(yīng)激、凋亡、腫瘤的重要信號通路[14]。薄荷活性成分可通過Relaxin信號通路發(fā)揮抗炎作用：relaxin-2可以抑制 TNF-α誘導(dǎo)的單核細胞對血管內(nèi)皮細胞的粘附[15]。

綜上所述，本文初次運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的策略研究膽舒膠囊醫(yī)治慢性膽囊炎分子機制，提示其可能通過抗炎鎮(zhèn)痛、解痙、利膽、抗菌等方面來治療慢性膽囊炎；成功地預(yù)測了膽舒膠囊治療慢性膽囊炎主要作用的靶點與相關(guān)的信號通路，發(fā)現(xiàn)膽舒膠囊經(jīng)過多組分-多靶點-多通路發(fā)揮醫(yī)治作用，為后續(xù)的實驗研究等提供參考。