吳安慶，聶 晶

（蘇州大學(xué) 放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

惡性腫瘤是威脅人類健康的高死亡率疾病之一。人類對(duì)于惡性腫瘤還沒(méi)有某種特別有效的治療方法，常用的治療手段為放射治療、手術(shù)治療和化學(xué)治療，約有50%～70%的腫瘤患者需要不同程度地接受放射治療[1]。隨著醫(yī)療影像技術(shù)、計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)迅速發(fā)展，放射治療設(shè)備不斷升級(jí)，放射治療進(jìn)入了“精準(zhǔn)放療”的時(shí)代，定位精度越來(lái)越高，劑量聚集性越來(lái)越好，能夠?qū)⒎派渚€全部集中在腫瘤部位進(jìn)行大劑量照射，并且避免腫瘤周圍正常組織接受照射，有效地減少放療的副作用[2]。因此，針對(duì)臨床前基礎(chǔ)研究的小動(dòng)物精準(zhǔn)放療設(shè)備也應(yīng)運(yùn)而生，主要用于放射生物學(xué)效應(yīng)機(jī)理、輻射防護(hù)藥物、多模態(tài)治療等研究的動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)。

1 小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)簡(jiǎn)介

小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)是一種圖像引導(dǎo)的可視化放射治療系統(tǒng)（small animal image-guided radiation therapy system）是為了解決臨床放療的疑難點(diǎn)和找到新的放療方法或途徑而生產(chǎn)的一款用于臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的放療儀器，其特點(diǎn)是在實(shí)施放療前，先對(duì)小動(dòng)物進(jìn)行精確的CT 三維成像，然后應(yīng)用專門的軟件，運(yùn)用蒙特卡洛算法制定放療計(jì)劃，最后按照制定好的放療計(jì)劃引導(dǎo)儀器對(duì)小動(dòng)物實(shí)施精確的放療[3]。本文以美國(guó)Precision X-ray (PXi)公司生產(chǎn)的X-RAD SmART 小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)為例，闡述小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)在小鼠腫瘤放療模型中的應(yīng)用。

X-RAD SmART 小動(dòng)物精準(zhǔn)放射治療系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)包括自屏蔽主機(jī)、X 射線發(fā)生單元、動(dòng)物平臺(tái)控制單元、成像單元、輻照單元、軟件控制單元，如圖1所示。

1.1 X 射線發(fā)生單元

（1）X 射線球管，最大管電壓225 kV，最大功率3 kW，雙焦點(diǎn)，焦點(diǎn)大小0.4 mm/3.0 mm（640 W/3 000 W），其中小焦點(diǎn)用于高分辨率成像，大焦點(diǎn)用于精確輻照；靶材料鎢；內(nèi)過(guò)濾0.8 mm Be；冷卻介質(zhì)純凈水。

（2）高壓發(fā)生器，最大輸出電壓225 kV，最小調(diào)節(jié)電壓0.1 kV；最大輸出電流45 mA，最小調(diào)節(jié)單位0.01 mA；最大輸出功率4.5 kW。

1.2 動(dòng)物平臺(tái)控制單元

（1）控制模式：成像或輻照時(shí)，動(dòng)物床固定不動(dòng)，X 射線球管和探測(cè)器以動(dòng)物床為軸做0°～360°圓周旋轉(zhuǎn)；旋轉(zhuǎn)速度可調(diào)節(jié)范圍0.01～3 r/min；旋轉(zhuǎn)定位精度6 arc/min。

（2）動(dòng)物平臺(tái)可三軸向同時(shí)調(diào)節(jié)，X 軸和Y 軸可調(diào)節(jié)距離（距等中心位置）±12.5 cm；Z 軸可調(diào)節(jié)距離（距等中心位置）±10.5 cm；調(diào)節(jié)速率36 mm/s；定位精度≤35 μm；定位可重復(fù)性≤±20 μm；動(dòng)物平臺(tái)可承受的動(dòng)物的最大重量≤5.5 kg。

1.3 成像單元

（1）CT 成像，成像方式為標(biāo)準(zhǔn)的錐束CT 成像；等中心體積分辨率100 μm；等中心成像體積10 cm×10 cm×10 cm；成像和重建時(shí)間最快20 s；幾何線性0.5 mm（不小于100 mm 距離）；成像時(shí)產(chǎn)生的最小輻射劑量率≤1 cGy/min。

（2）平板探測(cè)器，類型CsI 非晶硅探測(cè)器；實(shí)際像素1024×1024；像素單元大小200 μm；成像面積20 cm×20 cm；成像幀率15 fps；定位精度，標(biāo)準(zhǔn)模式，±0.25 mm；高分辨率模式±0.1 mm。

1.4 輻照單元

輻照劑量率范圍 1～400 cGy/min；X 射線過(guò)濾0.2 mm Al（用于成像），0.3 mm Cu（用于治療）；限束器（固定照射野）規(guī)格1～5 mm，圓孔或矩形孔；各向等中心距30 cm SSD；三束激光定位系統(tǒng)，方便對(duì)放射治療區(qū)域的定位和標(biāo)識(shí)；實(shí)時(shí)視頻監(jiān)控系統(tǒng)，方便對(duì)放射治療全過(guò)程的監(jiān)控。

1.5 軟件單元

放射治療計(jì)劃系統(tǒng)（TPS），CBCT 掃描工具和重建工具，3D CT 圖像的快速掃描和重建，最快速度20 s，最高分辨率100 μm，極大地縮短了整個(gè)放射治療的時(shí)間；數(shù)據(jù)庫(kù)管理工具，對(duì)獲取的每一幅圖像都建立獨(dú)立的識(shí)別碼，方便圖像的編輯、灰度匹配、分析、傳輸和分享；DICOM 輸入輸出工具，對(duì)不同平臺(tái)（MRI，PET-CT，SPECT-CT 等）的圖像數(shù)據(jù)可以分享和融合，進(jìn)一步增強(qiáng)了放射治療計(jì)劃的精確性和可評(píng)估重復(fù)性；劑量工具，采用最先進(jìn)的蒙特卡洛算法（Monte Carlo algorithms）進(jìn)行劑量的計(jì)算、校準(zhǔn)和評(píng)估。

圖1 X -RAD SmART 小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)

2 X -RAD SmART 小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)在小鼠腫瘤放療模型中的應(yīng)用

X-RAD SmART 小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)能夠在小動(dòng)物進(jìn)行治療前、治療中利用CT 掃描單元對(duì)腫瘤及正常器官進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)控，并能根據(jù)器官位置的變化調(diào)整治療條件使照射野緊緊“追隨”靶區(qū)，使之能做到真正意義上的精確治療。優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)三維的CT 成像，可精確地確定腫瘤在體內(nèi)的空間位置、形狀和大小，據(jù)此設(shè)計(jì)精準(zhǔn)的放療方案使得X 射線聚焦于腫瘤位置，并可以進(jìn)行多角度的照射[4]。在小鼠腫瘤放療實(shí)驗(yàn)中，一般常用的腫瘤模型是小鼠模型和人腫瘤裸鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下移植、腹腔注射移植、尾靜脈注射以及原位模型，本文以小鼠尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞建立肺部移植瘤模型為例[5-6]。

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF 級(jí)NOD/SCID 小鼠，雄性，6～8 周齡，體重18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；人源非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞株由蘇州大學(xué)哥倫比亞大學(xué)衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)室提供；攜帶有熒光素酶報(bào)告基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒購(gòu)于生工生物工程股份有限公司；D-螢光素鉀鹽購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；嘌呤霉素購(gòu)于美國(guó)GIBCO 公司；Ki67 抗體購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司。

2.2 小鼠腫瘤模型建立

首先將攜帶有熒光素酶報(bào)告基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，然后使用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549 細(xì)胞株。將生長(zhǎng)旺盛的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，消化離心清除培養(yǎng)基，重懸于生理鹽水中，尾靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射200 μL 生理鹽水，包含2×106個(gè)細(xì)胞，放回SPF 動(dòng)物房，繼續(xù)養(yǎng)殖20天后，觀察小鼠肺部成瘤情況，并準(zhǔn)備放射治療。

2.3 小鼠腫瘤模型的鑒定

小鼠注射上述能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549 細(xì)胞株20 d 后，將熒光素酶底物D-熒光素鉀鹽溶于生理鹽水中，配制成15 mg/mL 的D-螢光素鉀鹽溶液，按照10 μL/g 的體重濃度，通過(guò)腹腔注射入小鼠體內(nèi)，5 min 后使用小動(dòng)物成像儀觀察小鼠體內(nèi)熒光分布，如圖2 所示，熒光主要富集在小鼠的肺部，提示腫瘤細(xì)胞進(jìn)入小鼠血液循環(huán)后，大部分遷移至肺部成瘤。然后處死部分荷瘤小鼠，取出肺部，可以看到肺部表面突起了大小不一的腫瘤組織（見(jiàn)圖3），并制作石蠟病理切片，進(jìn)行HE 染色，如圖4(a)所示，肺部彌散浸潤(rùn)了大量的腫瘤灶，腫瘤區(qū)域與周圍正常肺癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯不同。進(jìn)一步通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)抗原Ki67 進(jìn)行染色，如圖4(b)所示，腫瘤部位著色明顯比正常組織深，顯示 Ki67 高表達(dá)。以上結(jié)果證明本實(shí)驗(yàn)用的小鼠腫瘤模型建立成功，可以用于下一步放射治療。

圖2 小鼠腫瘤模型的活體成像

圖3 小鼠肺部腫瘤

圖4 小鼠腫瘤模型染色結(jié)果

2.4 放射治療

將已經(jīng)成瘤的小鼠隨機(jī)分成兩組，每組10 只，一組為不照射對(duì)照組，另一組為放射治療組。放療條件為每隔6 d 照射一次，劑量率為2 Gy/min，一次照射4 Gy，共照射3 次，累積劑量12 Gy，觀察小鼠從第一次放療起，30 d 內(nèi)的生存率。照射方法：腹腔注射水合氯醛將小鼠麻醉，然后將小鼠放置在 X-RAD SmART 放射治療系統(tǒng)的小動(dòng)物床上，通過(guò)CT 控制軟件，對(duì)小鼠進(jìn)行CT 成像，然后在所成三維圖像上畫(huà)出照射靶區(qū)；再通過(guò)放療控制軟件，設(shè)置照射劑量，計(jì)算照射時(shí)間，并開(kāi)始照射（見(jiàn)圖5）。

圖5 小鼠腫瘤模型的肺部CT 掃描照片和肺部腫瘤放療靶區(qū)的確定

圖6 放射治療組與未治療對(duì)照組30 d 內(nèi)的生存率比較（“↑”表示照射X 射線）

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

連續(xù)3 次放療結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)小鼠放療后30 d 的生存情況，如圖6 所示，未進(jìn)行放射治療的小鼠，因?yàn)榉尾磕[瘤不斷增殖惡化，第30 d 小鼠的存活率僅為20%，而給予放射治療的小鼠，存活率為80%，說(shuō)明放射治療能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。

3 小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)的其他應(yīng)用

X-RAD SmART 小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)是專為臨床前應(yīng)用和研究而設(shè)計(jì)的精準(zhǔn)放射治療系統(tǒng)非常類似于臨床放療系統(tǒng)，即生物樣本保持靜止，檢測(cè)器圍繞樣本360°旋轉(zhuǎn)。這樣就能夠精確快速執(zhí)行在復(fù)雜3D 圖像引導(dǎo)下的精確治療，為腫瘤放射治療、放射生物學(xué)研究提供了高效率的臨床前研究平臺(tái)，可以加速臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。目前，X-RAD SmART 廣泛用于臨床前的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化輻射生物學(xué)研究、腫瘤放射治療研究等很多領(lǐng)域，包括：放射治療的臨床前驗(yàn)證、評(píng)估輻照風(fēng)險(xiǎn)、放射生物學(xué)效應(yīng)研究、DNA 損傷應(yīng)答研究、旁觀者效應(yīng)研究、輻射增敏劑研發(fā)、評(píng)估正常組織并發(fā)癥概率、腦和神經(jīng)及其他組織結(jié)構(gòu)和功能的研究、藥物有效性的研究[7-8]。

4 結(jié)語(yǔ)

放射治療在癌癥治療過(guò)程中扮演著非常重要的角色，無(wú)論是早期還是晚期的病灶。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的放射治療方法也不斷地更新，目前臨床治療癌癥的放射療法有立體消融照射療法（SABR）也稱作立體全身照射療法（SBRT）、強(qiáng)度調(diào)節(jié)照射療法（IMRT）、三維適形放療（3D-CRT）、網(wǎng)狀照射方法（GRID）等[9-13]。但是單獨(dú)使用放射治療很難有效控制癌癥發(fā)展，甚至聯(lián)合最好的化療藥物治療效果仍不理想。近幾年，大量研究者報(bào)道了免疫療法與傳統(tǒng)的放射療法相結(jié)合用于治療腫瘤具有良好的效果[14]。而精準(zhǔn)放療聯(lián)合其他癌癥治療方法的前期基礎(chǔ)研究，需要做大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本文以小鼠肺癌放療模型為例，闡述了小動(dòng)物精準(zhǔn)放療系統(tǒng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用，為研究放射治療與其他方法治療癌癥的協(xié)同效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案。