李增強 丁鑫超 盧 海 胡亞麗 岳 嬌 黃 震 莫良玉 陳 立 陳 濤 陳 鵬,*

專題

鉛脅迫下紅麻生理特性及DNA甲基化分析

李增強1丁鑫超1盧 海1胡亞麗1岳 嬌1黃 震1莫良玉1陳 立1陳 濤2陳 鵬1,*

1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 廣西高校植物遺傳育種重點實驗室, 廣西南寧 530004;2廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所, 廣西南寧 530004

DNA甲基化在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中起重要作用, 但是有關(guān)鉛脅迫下植物DNA甲基化水平變化的研究報道甚少。本研究以紅麻P3A為材料, 采用水培法對幼苗進行不同濃度(0、200、400、600 μmol L-1) PbCl2處理, 測定幼苗農(nóng)藝性狀、根系ROS含量和抗氧化酶活性等變化情況; 利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)分析600 μmol L-1鉛脅迫條件下根系DNA甲基化水平變化, 回收差異甲基化片段并克隆測序, 采用qRT-PCR技術(shù)對DNA甲基化差異基因進行表達分析。結(jié)果表明, 不同濃度PbCl2脅迫均顯著抑制幼苗的莖粗、根長和根表面積, 且400 μmol L-1及以上濃度PbCl2脅迫顯著抑制紅麻幼苗的株高和全鮮重。隨著鉛濃度的提高, 紅麻幼苗根系的鉛含量顯著升高, O2?和MDA含量顯著增加, SOD活性顯著升高, POD活性呈先降低后升高, CAT活性呈先升高后降低的趨勢。對照及600 μmol L-1PbCl2處理下的幼苗根系DNA甲基化率分別為71.13%、62.20%, 其中全甲基化率分別為50.52%、37.80%, 半甲基化率分別為20.62%、24.40%, 即鉛脅迫顯著降低了紅麻幼苗根系的DNA甲基化率和全甲基化率, 提高了根系的半甲基化率。qRT-PCR分析表明, 7個與抗性密切相關(guān)的DNA甲基化差異基因也存在表達量差異, 推測DNA甲基化水平變化在響應(yīng)紅麻鉛脅迫中發(fā)揮重要作用。本結(jié)果為深入探索DNA甲基化響應(yīng)植物非生物脅迫的潛在機制, 以及生產(chǎn)上利用紅麻改良土壤鉛污染提供了理論基礎(chǔ)。

紅麻; 鉛脅迫; DNA甲基化; 甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP); 實時熒光定量PCR (qRT-PCR); 抗氧化酶系統(tǒng)

土壤重金屬污染嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì), 并且通過食物鏈傳遞嚴(yán)重危害人類的健康。鉛是最嚴(yán)重的土壤污染重金屬之一, 有效治理土壤中的鉛污染是目前亟待解決的重大課題[1]。紅麻是世界上重要的纖維作物, 其生長迅速、生物量大、對重金屬耐受性強, 并且不進入食物鏈, 是重金屬污染土壤修復(fù)的理想作物[2]。

DNA甲基化在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)生物及非生物脅迫中起重要作用[3-4]。研究表明, 重金屬脅迫下, 植物的DNA甲基化水平和模式會發(fā)生改變,這可能是植物對逆境的應(yīng)急響應(yīng)[5]。甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技術(shù)是基于擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的, 它的主要原理是采用限制性內(nèi)切酶II和I對5′-CCGG-3′位點進行酶切, 由于這2種酶對該位點DNA甲基化的敏感性不同, 因此可以通過切割產(chǎn)生不同的片段來揭示DNA甲基化的程度, 該技術(shù)已廣泛用于植物基因組DNA甲基化水平的檢測[6-7]。何玲莉等[8]利用MSAP技術(shù)檢測不同濃度鉛脅迫對蘿卜肉質(zhì)根基因組DNA甲基化水平的變化發(fā)現(xiàn), 其甲基化水平隨著鉛濃度的提高而上升, 推測可能是由于鉛脅迫產(chǎn)生了大量的甲基自由基所致, 并且DNA甲基化水平的變化可以激活或者抑制相關(guān)基因的表達, 進而提高蘿卜對鉛脅迫的適應(yīng)性。郭丹蒂[9]運用MSAP技術(shù)發(fā)現(xiàn), 鉛和鎘脅迫均導(dǎo)致中華水韭DNA甲基化水平提高, 但與重金屬的濃度無顯著相關(guān)性。殷欣[10]也運用MSAP技術(shù)發(fā)現(xiàn), 大豆基因組DNA甲基化水平隨鎘濃度的增加而逐漸提高, 并且甲基化差異基因廣泛參與了植物響應(yīng)重金屬脅迫的過程。然而, 也有研究發(fā)現(xiàn), 重金屬脅迫導(dǎo)致基因組DNA甲基化水平降低的現(xiàn)象, 表明重金屬脅迫下DNA甲基化水平變化和響應(yīng)機制的復(fù)雜性[11]。

有關(guān)DNA甲基化響應(yīng)紅麻重金屬脅迫的研究尚未見報道。本研究利用不同濃度PbCl2對紅麻材料P3A幼苗進行脅迫處理, 研究幼苗農(nóng)藝性狀、ROS含量和抗氧化酶活性變化, 檢測鉛脅迫下基因組DNA甲基化水平變化, 并對甲基化差異片段進行克隆測序和表達水平分析, 以期為明確鉛脅迫對紅麻生長的影響, 揭示DNA甲基化響應(yīng)紅麻鉛脅迫的潛在機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

紅麻材料P3A由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院周瑞陽教授提供。挑選適量籽粒飽滿的種子, 常溫條件下用蒸餾水浸泡1 h, 經(jīng)3%過氧化氫消毒10 min, 再用蒸餾水沖洗3次, 均勻地擺放在鋪有2層紗布(注意定期定量添加1/4 Hoagland營養(yǎng)液, 始終保持紗布濕潤)的塑料盒(27 cm′18 cm′9 cm)中, 放置于恒溫光照培養(yǎng)箱(光/暗周期為10 h/14 h, 溫度為白天27℃/夜晚25℃, 下同)中培養(yǎng)7 d后, 選取長勢一致的幼苗240株, 隨機分成12組, 每組20株, 移栽于12個底部含有托盤的育苗盤(21孔花卉育苗盤)中, 即為4個處理, 每個處理3次重復(fù)。向托盤中分別添加含有不同PbCl2濃度(0、200、400、600 μmol L-1)的1/4 Hoagland處理液, 注意每天定量地更換處理液。

1.2 農(nóng)藝性狀及生理指標(biāo)的測定

脅迫處理7 d后, 全部材料用蒸餾水清洗干凈并用吸水紙擦干, 分別用直尺、游標(biāo)卡尺和電子天平測定各單株的株高、莖粗、全鮮重, 并利用根系掃描分析儀(EPSON EXPRESSION 10000XL)對根系進行掃描分析。之后將材料用液氮速凍后保存于-80℃冰箱, 用于后續(xù)試驗。

分別采用羥胺氧化法[12]、硫代巴比妥酸法[13]測定根系的超氧陰離子(superoxide anion, O2?)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量; 分別采用氮藍四唑法[13]、愈創(chuàng)木酚法[13]、紫外分光光度法[12]測定根系的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性。

1.3 甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)分析

參考Tang等[14]報道的MSAP方法并加以改良, 對部分處理(0、600 μmol L-1)的根系進行DNA甲基化水平分析。首先采用改良CTAB法[15]提取上述材料的基因組DNA, 之后分別用R I/II和R I/I 兩種酶組合進行雙酶切, 連接, 預(yù)擴增、選擇性擴增, 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳, 銀染、顯色, 拍照保存并進行MSAP多態(tài)性片段的統(tǒng)計。雙酶切體系(3種酶均購于NEB公司)為R I 0.5μL、II或I 0.5 μL、CutSmart buffer 2 μL、模板DNA (100 ng μL-1) 4 μL、ddH2O 13 μL; 程序為37℃ 6 h, 80℃ (R I/II)或65℃ (R I/I) 20 min。連接體系為正反向引物(10 μmol L-1)各1 μL、T4DNA Ligase (350 U μL-1, TaKaRa公司) 2 μL、10×T4DNA Ligase buffer 2 μL、酶切產(chǎn)物14 μL; 程序為16℃ 14 h, 65℃ 20 min。預(yù)擴增和選擇性擴增體系均為稀釋10倍后的連接產(chǎn)物或預(yù)擴增產(chǎn)物5 μL、正反向引物(10 μmol L-1)各1 μL、2×RapidMaster Mix (南京諾唯贊生物科技有限公司) 10 μL、ddH2O 3 μL; 程序均為95℃ 3 min; 95℃ 15 s, 60℃ (以每對引物的平均m值為準(zhǔn)) 15 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán); 72℃ 5 min。接頭序列、預(yù)擴增和選擇性擴增引物序列見表1。

表1 接頭和引物序列

MSAP多態(tài)性條帶標(biāo)記方法如下: 同一水平線上,R I/II和R I/I酶切都有帶, 記為I型(無甲基化);R I/II酶切有帶而R I/I酶切無帶, 記為II型(半甲基化);R I/II酶切無帶而R I/I酶切有帶, 記為III型(全甲基化);R I/II和R I/I酶切都無帶, 記為IV型(全甲基化)。DNA甲基化水平統(tǒng)計方法如下: 甲基化條帶數(shù) = II型+III型+IV型, 甲基化率 = (II型+III型+IV型)/(I型+II型+III型+IV型)′100%; 半甲基化條帶數(shù) = II型, 半甲基化率 = II型/(I型+II型+III型+IV)′100%; 全甲基化條帶數(shù) = III型+IV型, 全甲基化率 = (III型+IV型)/(I型+II型+III型+IV型)′100%[7]。

1.4 甲基化差異片段的回收、克隆和測序分析

對顯色后的6%變性聚丙烯酰胺凝膠結(jié)果進行照相和MSAP多態(tài)性片段統(tǒng)計后, 切下觀察到的甲基化差異片段于1.5 mL離心管中, 加入30 μL ddH2O, 煮沸10 mim, 用槍頭將膠塊搗碎, 短暫離心后取上清進行PCR擴增。體系包含上清10 μL、選擇性擴增時的正反向引物(10 μmol L-1)各4 μL、2×RapidMaster Mix 50 μL、ddH2O 32 μL, PCR程序同選擇性擴增。之后進行2%瓊脂糖凝膠電泳及膠回收。使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的T1 Cloning Kit進行克隆, 陽性克隆經(jīng)PCR方法鑒定后, 送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果在紅麻基因組數(shù)據(jù)庫[16](https://bigd.big.ac.cn/gwh)及NCBI網(wǎng)站上進行Nucleotide BlAST同源性比對。

1.5 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析

利用改良異硫氰酸胍法[17]分別提取相應(yīng)根系材料(0, 600 μmol L-1)的RNA, 并進行1%瓊脂糖凝膠電泳, 采用超微量紫外分光光度計檢測RNA的質(zhì)量和濃度, 之后使用諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號: R223-01)反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 并以此為模板進行qRT-PCR分析。以組蛋白基因為內(nèi)參基因, 采用2?ΔΔCT方法[2]計算基因的相對表達量, qRT-PCR引物序列見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PbCl2脅迫對紅麻幼苗農(nóng)藝性狀的影響

對不同濃度PbCl2脅迫下紅麻幼苗農(nóng)藝性狀的測定發(fā)現(xiàn)(表3), 低濃度(200 μmol L-1) PbCl2脅迫對幼苗的株高、全鮮重和根鮮重?zé)o顯著抑制, 中濃度(400 μmol L-1)及高濃度(600 μmol L-1)脅迫下均出現(xiàn)顯著抑制。說明低濃度PbCl2脅迫對紅麻幼苗生長無明顯的影響, 紅麻具有較強的鉛耐受性。不同濃度PbCl2脅迫均顯著抑制了幼苗的莖粗、根長和根表面積。中濃度和高濃度PbCl2脅迫對幼苗生長的抑制除在株高方面呈顯著性差異外, 在其他方面均無顯著性差異。

2.2 不同濃度PbCl2脅迫對紅麻幼苗根系鉛含量的影響

由圖1可知, 隨著PbCl2濃度的逐漸增加, 根系中的鉛含量顯著升高。紅麻幼苗根系的鉛含量在對照條件下為3.59 mg kg-1, 低濃度(200 μmol L-1)、中濃度(400 μmol L-1)和高濃度(600 μmol L-1) PbCl2脅迫分別使根系的鉛含量增加了34、138和203倍。結(jié)合對紅麻幼苗農(nóng)藝性狀的測定結(jié)果得出, 本研究中不同濃度PbCl2脅迫雖然顯著增加了幼苗根系中鉛的積累, 但是并沒有嚴(yán)重影響到紅麻的生長, 說明紅麻對鉛脅迫具有較強的耐受性。

2.3 不同濃度PbCl2脅迫對紅麻幼苗根系抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖2可知, 隨著PbCl2脅迫濃度的升高, 紅麻幼苗根系的O2?(圖2-A)和MDA含量(圖2-B)、以及SOD活性(圖2-C)總體上都呈逐漸上升的趨勢。POD活性(圖2-D)呈先下降后緩慢上升的趨勢, 高濃度(600 μmol L-1) PbCl2脅迫下活性最高, 其次為對照條件和中濃度(400 μmol L-1), 低濃度(200 μmol L-1) PbCl2脅迫下活性最低。CAT活性(圖2-E)呈先上升后降低的趨勢, 中濃度PbCl2脅迫下活性最高, 其次為高濃度和低濃度, 對照條件下活性最低。各項指標(biāo)在不同濃度PbCl2脅迫下都呈顯著性差異。即不同濃度PbCl2脅迫均使紅麻幼苗根系的O2?和MDA含量升高, SOD和CAT活性上升。POD活性在高濃度脅迫下升高, 中濃度和低濃度脅迫下降低。說明鉛脅迫使紅麻幼苗根系發(fā)生了膜脂過氧化,但其自身的抗氧化酶活性也會相應(yīng)提高, 以清除過量ROS的產(chǎn)生, 使鉛脅迫對幼苗的傷害降到最低。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

表3 不同濃度PbCl2脅迫對紅麻幼苗農(nóng)藝性狀的影響

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

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不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

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2.4 PbCl2脅迫對紅麻幼苗根系DNA甲基化水平的影響

運用MSAP技術(shù)分析了600 μmol L-1PbCl2脅迫和對照條件下紅麻幼苗根系的DNA甲基化水平, 部分代表性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖3, 統(tǒng)計結(jié)果見表4。對照條件下, 幼苗根系的DNA甲基化率為71.13%, 其中全甲基化率和半甲基化率分別為50.52%和20.62%。600 μmol L-1PbCl2脅迫下, 幼苗根系的DNA甲基化率為62.2%, 其中全甲基化率和半甲基化率分別為37.8%和24.4%。即600 μmol L-1PbCl2脅迫使幼苗根系的DNA甲基化率和全甲基化率降低, 半甲基化率升高。表明在整體水平上, 600 μmol L-1PbCl2脅迫降低了紅麻幼苗根系的DNA甲基化水平。

2.5 甲基化差異片段的測序及qRT-PCR分析

本研究共擴增出291條MSAP多態(tài)性片段, 回收到97條DNA甲基化差異片段, 測序比對得到38條具有功能的DNA甲基化差異序列。與植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境相關(guān)的甲基化差異序列測序結(jié)果見表5, 其中14條DNA甲基化差異序列比對到的同源基因與響應(yīng)植物抗逆性密切相關(guān), 例如AT-hook家族基因()、SGT家族基因()、S-腺苷-L-蛋氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白(SAM- MET)、NRT1/PTR家族蛋白(NPF5.4)、RaBa家族蛋白(RaBa1f)、Ran GTPase結(jié)合蛋白(GTPase)、WD40重復(fù)序列蛋白(WD40)、乙烯過表達蛋白(ETO1)、液泡分選蛋白(VPS13F)、β-甘露聚糖酶(β-man6)、類受體蛋白激酶(PLK)、纖維素合成酶(CesA2)、果膠酯酶抑制劑(PME7)、線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位因子(TIM21)。

挑選以上部分DNA甲基化差異基因?qū)?00 μmol L-1PbCl2脅迫和對照條件下的紅麻幼苗根系進行qRT-PCR分析。由圖4可知, 11個與響應(yīng)植物抗性密切相關(guān)的DNA甲基化差異基因中, 有7個基因在PbCl2脅迫下的表達量與對照呈顯著性差異。其中基因、、、、的表達量在PbCl2脅迫下顯著降低, 基因、、的表達量在PbCl2脅迫下顯著升高。說明這些基因的DNA甲基化情況變化與基因表達水平變化密切相關(guān), 并且DNA甲基化變化對基因表達水平的影響是復(fù)雜多樣的。DNA甲基化水平的升高大多數(shù)情況下抑制基因的表達, 但也存在對基因表達水平起促進作用, 或者無顯著影響的情況[4]。

泳道1和3代表R I/II酶切, 泳道2和4代表R I/I酶切。1和2: PbCl2-0; 3和4: PbCl2-600。虛線方框: I型(無甲基化); 白色方框: II型(半甲基化); 黑色方框: III型(全甲基化); 虛點方框: IV型(全甲基化)。

The left lane 1, 3 and right lane 2, 4 represent digestion withR I/II andR I/I respectivelyThelane 1, 2, and 3, 4 represent thePbCl2-0, PbCl2-600 respectively. The dotted line frame, white frame, black frame and virtual point frame represent the type I (no methylation), type II (hemi-methylation), type III (full methylation), and type IV (full methylation), respectively.

表4 DNA甲基化水平統(tǒng)計分析

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Bars superscripted by different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 probability level.

3 討論

3.1 紅麻可以作為修復(fù)鉛污染土壤的潛在作物

研究表明, 禾本科牧草和黃化楓林木的生物量隨著土壤中鉛濃度的逐漸增加呈先升高后降低的趨勢[24-25], 低濃度鉛脅迫可以促進小麥種子的萌發(fā)[25]。本研究表明, 低濃度(200 μmol L-1) PbCl2脅迫對紅麻幼苗的生長無明顯的影響, 而在較高濃度(400 μmol L-1以上)則表現(xiàn)出明顯的抑制, 并且一定濃度范圍內(nèi)(400~600 μmol L-1)鉛脅迫對幼苗生長的抑制并無顯著性差異, 表明紅麻具有較強的鉛耐受性。由于紅麻以收獲營養(yǎng)器官為目的, 不進入食物鏈, 因此生產(chǎn)上可以利用紅麻能夠吸收土壤中的重金屬鉛, 并且對其產(chǎn)量無明顯影響的優(yōu)勢來改良土壤。

植物在正常的生長發(fā)育條件下, 活性氧的產(chǎn)生與清除之間時常處于良性的動態(tài)平衡狀態(tài)[27]。當(dāng)植物遭受生物或非生物脅迫后, 這種動態(tài)平衡就會被打破, 導(dǎo)致植物體內(nèi)積累大量的活性氧, 例如積累過量的O2–使膜發(fā)生過氧化作用, 產(chǎn)生過量丙二醛(MDA), 使細(xì)胞膜及細(xì)胞器破壞解體, 最終影響植物的生長發(fā)育[23-24,27]。與此同時, 當(dāng)植物遭受逆境脅迫時, 負(fù)責(zé)清除活性氧的抗氧化酶等系統(tǒng)的活性會相應(yīng)提高, 使對植物的傷害降到最低, 但當(dāng)脅迫程度嚴(yán)重時, 會引起抗氧化酶系統(tǒng)紊亂, 無力清除更多的活性氧, 最終嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育[28-29]。本研究表明, 不同濃度PbCl2脅迫均顯著提高了紅麻幼苗根系的O2?和MDA含量, 以及SOD和CAT的活性, POD活性也在高濃度鉛脅迫下顯著升高。表明紅麻具有較強的抗氧化系統(tǒng), 可以在一定范圍內(nèi)清除鉛脅迫產(chǎn)生的ROS以緩解對紅麻生長的影響。

3.2 鉛脅迫降低了紅麻幼苗根系的DNA甲基化水平

本研究首次檢測了紅麻幼苗根系的DNA甲基化水平, 并得出600 μmol L-1PbCl2脅迫使幼苗根系的DNA甲基化率和全甲基化率降低, 半甲基化率升高, 即整體上降低了幼苗根系的DNA甲基化水平。這與李雪林等[30]和高桂珍等[31]在其他作物中的研究結(jié)果一致, 但也有相反的結(jié)論[8-9]。這可能是由于不同作物和不同非生物脅迫的特性, 或者鉛脅迫濃度和處理時間不同而導(dǎo)致的。也有研究表明, 楓樹在不同濃度鹽脅迫下的DNA甲基化水平變化情況不同, 并且相同濃度鹽脅迫對不同組織DNA甲基化水平變化的影響也不盡相同[31], 說明植物響應(yīng)非生物脅迫時, DNA甲基化情況變化的復(fù)雜性。

3.3 紅麻鉛脅迫下DNA甲基化變化參與調(diào)控抗性相關(guān)基因的表達

本研究發(fā)現(xiàn)了7個已報道的與植物抗逆性密切相關(guān)的基因在鉛脅迫下同時存在DNA甲基化和基因表達水平的差異, 因此我們推測DNA甲基化水平的變化可能參與調(diào)控這些基因的表達, 進而調(diào)控紅麻對鉛脅迫的響應(yīng)。在水稻中已經(jīng)鑒定出49個與生長發(fā)育和響應(yīng)脅迫相關(guān)的果膠酯酶抑制劑PMEI家族基因[21]。PMEI家族基因參與植物油菜素內(nèi)酯的調(diào)節(jié)[33], 很多基因也抑制蔗糖轉(zhuǎn)移酶的活性[21], 影響植物的抗逆性。本研究中甲基化差異基因在鉛脅迫下幾乎不表達, 因此可能對油菜素內(nèi)酯和蔗糖的合成起到促進作用, 提高紅麻幼苗對鉛脅迫的適應(yīng)性。纖維素合酶CesA在纖維素和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的合成中起重要作用[20,34], 擬南芥及基因表達水平的下調(diào)可以增強對葡萄孢菌的抗病性[35]。DNA甲基化可能通過調(diào)控纖維素合成酶基因的表達促進纖維素的合成, 最終可以提高擬南芥的抗鹽性[36]。本研究中纖維素合酶的甲基化情況在鉛脅迫下發(fā)生了改變, 基因表達量顯著下調(diào), 因此推測其甲基化情況的變化在調(diào)控基因表達、促進纖維素合成, 進而在響應(yīng)鉛脅迫方面起到了一定的作用。AT-hook家族基因在植物的生長發(fā)育、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)逆境脅迫中起重要的作用, 部分AT-hook家族基因表達量的變化很可能參與到了番茄響應(yīng)逆境脅迫中[19]。NRT1/PTR家族蛋白在植物轉(zhuǎn)運硝酸鹽、鉀鹽、氨基酸和植物激素過程中起重要的作用[37-38]。本研究中AT-hook家族的甲基化差異基因在鉛脅迫下幾乎不表達, NRT1/PTR家族基因在鉛脅迫下的表達量顯著降低, 可能會影響營養(yǎng)元素和植物激素的轉(zhuǎn)運, 使紅麻幼苗在鉛脅迫下生長受抑。有研究報道SGT1家族基因與植物的抗病性密切相關(guān)[39], 李為民等[40]研究發(fā)現(xiàn),過表達的轉(zhuǎn)基因煙草對赤星病菌的抗性明顯提高, 擬南芥基因突變體對霜霉病的抗性大大降低[39]。本研究中, 甲基化情況的變化使得抗病基因的表達量顯著降低, 且該基因也可能參與到了植物非生物脅迫的響應(yīng)中。

類受體蛋白激酶PLKs廣泛參與植物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫的響應(yīng)過程, 水稻基因正向調(diào)控水稻的抗鹽性, 高鹽脅迫下其突變體的存活率降低, MDA含量升高, SOD和CAT活性降低[41]。本研究中甲基化差異基因在鉛脅迫下的表達量顯著升高, 因此可能抑制MDA的積累, 提高抗氧化酶的活性, 進而提高紅麻幼苗對鉛脅迫的適應(yīng)性。RaBa家族基因在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要的作用[42], 轉(zhuǎn)基因擬南芥受脅迫的影響更小[43]。核桃WD40轉(zhuǎn)錄因子基因參與到了逆境脅迫的響應(yīng)當(dāng)中[44], 夏凱文[23]也發(fā)現(xiàn),WD40重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域蛋白是擬南芥生長發(fā)育和脅迫信號傳遞的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究中甲基化差異基因和在鉛脅迫下的表達量均顯著提高, 因此推測DNA甲基化水平的變化參與以上抗性基因的表達, 從而啟動了紅麻幼苗對鉛脅迫的應(yīng)急響應(yīng)。

4 結(jié)論

紅麻對鉛脅迫具有較強的耐受性, 并且一定濃度范圍內(nèi)的鉛脅迫對紅麻生長的抑制無顯著差異, 生產(chǎn)上可以利用紅麻來改良重金屬鉛污染土壤。一定濃度范圍內(nèi)的鉛脅迫下, 紅麻幼苗可以通過提高自身的抗氧化酶活性來清除過量ROS的產(chǎn)生。600 μmol L-1PbCl2脅迫使幼苗根系整體的DNA甲基化水平降低, 與植物抗逆性密切相關(guān)的AT-hook家族基因、NRT1/PTR家族蛋白、RaBa家族蛋白、SGT家族基因、WD40重復(fù)序列蛋白、類受體蛋白激酶、纖維素合成酶等相關(guān)基因在鉛脅迫下都發(fā)生了DNA甲基化和基因表達水平的顯著變化。推測紅麻幼苗可以通過自身的抗氧化酶系統(tǒng), 及DNA甲基化水平變化來響應(yīng)鉛脅迫, 以消除或減輕鉛脅迫對紅麻生長的影響。

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Physiological characteristics and DNA methylation analysis under lead stress in kenaf (L.)

LI Zeng-Qiang1, DING Xin-Chao1, LU Hai1, HU Ya-Li1, YUE Jiao1, HUANG Zhen1, MO Liang-Yu1, CHEN Li1, CHEN Tao2, and CHEN Peng1,*

1College of Agriculture, Guangxi University / Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Plant Genetics and Breeding, Nanning 530004, Guangxi, China;2Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning 530004, Guangxi, China

DNA methylation plays an important role in response to plant biotic and abiotic stresses, but there are few reports on the changes of plant DNA methylation level under lead stress. In this study, kenaf (L.) P3A was used as the material, the seedlings were cultured in Hoagland solution, and treated with at different concentrations (0, 200, 400, and 600 μmol L-1) of PbCl2. The changes of agronomic traits, ROS content and antioxidant enzyme activity of root were investigated. The changes of DNA methylation level in roots under 600 μmol L–1lead stress were determined by methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP). The differentially methylated genes (DMGs) were cloned, sequenced, and functionally annotated. In addition, the expression levels of DMGs were investigated by qRT-PCR. The results showed that the stem diameter, root length and root surface area of seedlings were significantly inhibited by different concentrations of PbCl2stress. And the plant height and total fresh weight of kenaf seedlings were significantly reduced under 400 μmol L-1concentration or more of lead stress. The content of lead, O2?and MDA, and activities of SOD were increased significantly in kenaf seedlings roots, CAT activity increased first and then decreased with the increase of lead concentration, the POD activity showed a trend of decreasing first and then increasing. MSAP analysis of roots treated with 0 μmol L-1and 600 μmol L-1PbCl2showed that DNA methylation rates were 71.13%, 62.20%, fully methylated ratio was 50.52%, 37.80%, and hemi-methylated ratio were 20.62%, 24.40%, respectively. In other words, lead stress significantly reduced DNA methylation rate and total methylation rate, whereas increased the hemi-methylation rate of roots of kenaf seedlings. qRT-PCR analysis showed that there were also differences in gene expression of seven DMGs closely related to resistance. It suggested that the change of DNA methylation level played an important role in kenaf response to lead stress in kenaf. This study provides a theoretical basis for further exploring the potential mechanism of DNA methylation in response to plant abiotic stress, and improving soil lead pollution in kenaf production.

kenaf; lead stress; DNA methylation; MSAP; qRT-PCR; antioxidant enzyme system

10.3724/SP.J.1006.2021.04104

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31560341, 31960368)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-16-E14)資助。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31560341, 31960368) and the China Agriculture Research System (CARS-16-E14).

陳鵬, E-mail: hustwell@gmail.com

E-mail: 1134485681@qq.com

2020-05-08;

2020-08-19;

2020-09-10.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200908.1800.005.html