劉子同，袁久剛，薛 琪，范雪榮，高衛(wèi)東

(生態(tài)紡織教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫 214122)

低共熔體系的物理化學性質(zhì)與傳統(tǒng)的低溫熔融鹽相似，因此又被稱作“類離子液體”[1]。其通常由膽堿鹽和配位劑(如金屬鹽、金屬鹽水合物或氫鍵供體等)組合而成，但與傳統(tǒng)的低溫熔融鹽相比，低共熔體系還具有原料來源廣泛、不揮發(fā)、無毒、可降解、價格低廉以及容易制備等優(yōu)點[2-3]。

近年來，低共熔體系在天然高分子溶解方面獲得了研究者的廣泛關注，尤其是在木質(zhì)素溶解方面。例如：Tehunen等[4]和Chen等[5]利用氯化膽堿-乳酸低共熔體系對木質(zhì)素進行溶解，實現(xiàn)了木質(zhì)素和纖維素的有效分離；Marino等[6]研究了木質(zhì)素在尿素-氯化膽堿低共熔體系中的解聚；Biswas等[7]發(fā)現(xiàn)淀粉也可以溶于草酸-氯化膽堿低共熔體系中。郭振[8]用幾種離子液體和低共熔體系實現(xiàn)了糖類化合物的溶解，具有一定成效。蒲磊等[9]用尿素-氯化膽堿低共熔體系溶解纖維素，分析纖維素與該體系的作用方式，證明了該體系能夠有效溶解纖維素。這些研究都表明在天然高分子的溶解和再生方面，低共熔體系具有較大的應用前景。

姜哲等[10-11]研究了天然角蛋白在尿素-氯化膽堿低共熔體系中的溶解及其機制，發(fā)現(xiàn)尿素-氯化膽堿體系可以對角蛋白纖維進行溶解，但由于缺乏還原性，不能有效打開羊毛中的二硫鍵，導致溶解效率不高。本文在其研究基礎上發(fā)現(xiàn)了一種新型的還原型低共熔體系——巰基乙酸膽堿，該體系具有優(yōu)良的二硫鍵破壞能力，可用于雞毛等廢棄羽毛的溶解再生，本文研究了該體系對雞毛角蛋白的溶解機制及再生角蛋白的特征，制備了多孔復合材料。對雞毛等廢棄毛發(fā)資源的有效利用具有較好的啟示。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

雞毛，家禽市場自行收集；巰基乙酸膽堿，質(zhì)量分數(shù)95%，上海成捷離子液體有限公司。

XPV600E 電腦型偏光顯微鏡(上海比目儀器有限公司)；NICOLET is10傅里葉變換光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；D8 X射線衍射儀(德國 Bruker 公司)；Mini-protean Tetro Cells 電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 脫脂處理

將雞毛洗凈自然晾干后，利用粉碎機進行初步粉碎，過篩之后稱取適量粉碎雞毛粉置于索氏提取器中，用丙酮抽提脫脂48 h，60 ℃烘干后備用。

1.3 再生角蛋白提取

稱取1 g脫脂雞毛粉，將其置于20 g巰基乙酸膽堿中，于120 ℃磁力加熱攪拌溶解一定時間，得到黃色混合液，然后向混合液加入適量8 mol/L尿素溶液，靜置15 min，采用砂芯漏斗過濾，濾液用透析袋(截留相對分子質(zhì)量8 000～12 000 Da)透析3天，將可溶性蛋白溶液冷凍干燥，得到再生角蛋白。

1.4 溶解過程觀察

將單根雞毛纖維置于盛有巰基乙酸膽堿的特制載玻片凹槽中，利用熱臺加熱，用數(shù)碼偏光顯微鏡觀察其溶解過程，拍照記錄。

1.5 紅外光譜(FTIR)測試

采用KBr壓片法分別測試雞毛粉和再生雞毛角蛋白粉的紅外反射光譜。測試條件：掃描范圍 4 000～600 cm-1，分辨率0.4 cm-1，掃描32次。

1.6 X射線衍射(XRD)測試

采用D8 X射線衍射儀分別對雞毛粉和再生角蛋白進行測試，測試條件：Cu靶，工作電壓30 kV，工作電流10 mA，掃描范圍5°～50°，步長0.02 (°)/min。

1.7 凝膠電泳(SDS-PAGE)測試

采用Mini-protean Tetro Cells 電泳系統(tǒng)對雞毛和再生角蛋白分別進行測試，測試使用的SDS-PAGE凝膠質(zhì)量分數(shù)為12%，標準蛋白指示劑為10～270 kDa。

1.8 多孔材料制備

將角蛋白溶液用聚乙二醇(相對分子質(zhì)量20 000)濃縮至 60 g/L后，加入一定比例的PEG 400(聚乙二醇，相對分子質(zhì)量400)，在37 ℃下將其混勻，之后將溶液倒入24孔板中，靜置脫泡并冷卻至室溫后，-20 ℃ 冷凍8 h，-40 ℃ 冷凍干燥36 h，即可得到角蛋白多孔復合材料。

1.9 毒理性能測試

按照ISO 10993-5—2009《醫(yī)療器械生物學評價第5部分:細胞毒性體外試驗》，采用直接接觸的方法測試毒理性。取100 μL的 NIH/3T3細胞(小鼠胚胎細胞)懸浮液注入細胞培養(yǎng)板中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，最后加10 μL細胞計數(shù)試劑CCK-8到各孔板中反應1 h，用酶標儀記錄450 nm處吸光度，每種樣品重復測試3次，計算細胞存活率：

細胞存活率=A1/A0×100%

式中：A1和A0分別為樣品和空白樣的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞毛溶解過程偏光觀察

雞毛在巰基乙酸膽堿中的溶解過程見圖1。

圖1 雞毛在巰基乙酸膽堿中的溶解過程(120 ℃)

從圖1可以看出，雞毛在巰基乙酸膽堿體系中可以發(fā)生快速溶解，13 min左右即可以完全溶解消失(圖1(f))。溶解時，首先發(fā)生羽小枝的溶解，之后羽枝和羽軸逐漸溶解變細(圖1(b)～(d))，隨著溶解時間繼續(xù)延長，羽枝進一步變細，而羽軸也逐漸斷裂(圖1(e))。在此過程中，羽軸中的二硫鍵被巰基乙酸膽堿還原為硫化氫氣體(硫化鉛試紙檢測時變黑)，導致視野中產(chǎn)生較多小氣泡(圖1(d)～(e))。綜合來看，雞毛角蛋白中的構(gòu)象以β折疊為主，相對于羊毛等α-角蛋白纖維，其含硫量較低。巰基乙酸膽堿低共熔體系不僅具有較強的氫鍵拆散作用，而且具有對二硫鍵的還原能力，在其雙重作用下，雞毛角蛋白可以發(fā)生快速溶解。

2.2 再生角蛋白的結(jié)構(gòu)性能表征

2.2.1 化學結(jié)構(gòu)分析

雞毛及其再生角蛋白的紅外光譜圖見圖2。

圖2 雞毛及其再生角蛋白的紅外光譜圖

由圖2可以看出，雞毛和再生角蛋白都含有角蛋白的特殊吸收峰，在酰胺A帶(3 300～3 290 cm-1)、酰胺I帶(1 650 cm-1)、酰胺Ⅱ帶(1 540～1 530 cm-1)以及酰胺Ⅲ帶(1 243～1 237 cm-1)均有明顯的酰胺鍵吸收[12]，這說明溶解再生的雞毛角蛋白保留了完好的蛋白結(jié)構(gòu)。相對原雞毛，再生角蛋白在1 070 cm-1和958 cm-1附近出現(xiàn)了一些新的特征峰，這是胱氨酸一氧化物所引起的伸縮振動吸收峰[13-14]，該吸收峰在原雞毛角蛋白中基本不存在，初步判斷這是由于雞毛角蛋白在巰基乙酸膽堿溶解過程中，其所含的部分二硫鍵被還原為巰基，在高溫條件下又被空氣氧化為胱氨酸所致。

2.2.2 晶體結(jié)構(gòu)分析

為了研究結(jié)晶度變化，對其進行X射線衍射分析，雞毛及其再生角蛋白X射線衍射圖譜見圖3。

圖3 雞毛及其再生角蛋白X射線衍射圖譜

從圖3可以看出，雞毛及再生角蛋白在9°及20°附近都存在明顯的晶體衍射峰[15]。與原雞毛相比，再生角蛋白在20°附近特征峰強度略有下降，但是9°附近特征峰強度有所下降，說明雞毛在巰基乙酸膽堿溶解再生過程中，二級結(jié)構(gòu)被破壞，再生角蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊都降低，但是無規(guī)結(jié)構(gòu)增加。

2.2.3 分子量分析

雞毛及其再生角蛋白電泳分析見圖4。

圖4 雞毛及其再生角蛋白電泳分析

從圖4可以看出，原雞毛角蛋白(圖4(b))泳道在35 kDa 以下，在40～170 kDa范圍內(nèi)顏色較淺，但也存在一定分子量分布。經(jīng)巰基乙酸膽堿再生后的角蛋白(圖4(a))，其高分子量區(qū)域(20～170 kDa范圍)顏色進一步變淺，近乎無色，而低分子量區(qū)域(<20 KDa)顏色進一步升高。說明角蛋白在溶解再生過程中由于二硫鍵等價鍵的斷裂，大部分降解為小分子蛋白。

2.2.4 雞毛和再生角蛋白的氨基酸分析

雞毛及其再生角蛋白的氨基酸分析見圖5。

Asp—天冬氨酸；Glu—谷氨酸；Ser—絲氨酸；His—組氨酸；Gly—甘氨酸；Thr—蘇氨酸；Arg—精氨酸；Ala—丙氨酸；Tyr—酪氨酸；Cys—半胱氨酸；Val—纈氨酸；Met—甲硫氨酸；Phe—苯丙氨酸；Ile—異亮氨酸；Leu—亮氨酸；Lys—賴 氨酸；Pro—脯氨酸。

由圖5可以看出，雞毛經(jīng)巰基乙酸膽堿溶解再生后，其再生角蛋白中各氨基酸組成與原雞毛組成相似，但是氨基酸相對含量大部分均有所降低。這是由于溶解再生時，在溶液中會產(chǎn)生部分氨基酸流失；其中，半胱氨酸含量降低50%以上，最為明顯，可能是在雞毛溶解過程中，由于巰基乙酸膽堿的強烈還原作用，使得羽軸和羽枝中存在的大量二硫鍵被還原，一部分轉(zhuǎn)化成為硫化氫氣體，而另一部分則轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘碾装彼嵫趸?，最終導致含硫氨基酸的大幅度降低。

2.3 角蛋白多孔材料

再生角蛋白多孔材料形貌見圖6。

圖6 再生角蛋白多孔材料形貌

從圖6(a)可以看出，角蛋白/PEG混合材料能夠通過凍干法形成均勻的多孔材料，結(jié)構(gòu)較為疏松，具有像海綿一樣的彈性。由圖6(b)可以看出，再生雞毛角蛋白截面呈疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小介于10～100 μm之間，比較均勻，這對于細胞在組織材料上的生長和擴散具有重要意義。對其生物細胞毒理性測試結(jié)果表明，再生角蛋白評級為：對細胞無毒，其增殖率 >100%，說明角蛋白具有較好的生物相容性。

3 結(jié) 論

巰基乙酸膽堿還原型低共熔體系，具有優(yōu)良的二硫鍵破壞能力以及氫鍵拆散能力，在廢棄羽毛等天然角蛋白資源的溶解再利用方面具有廣闊的應用前景。

①采用巰基乙酸膽堿低共熔體系可以高效溶解雞毛，制備雞毛再生角蛋白。在溶解過程中，角蛋白主體結(jié)構(gòu)并沒有完全破壞，但是其結(jié)晶度和分子量都有一定程度降低，氨基酸組成也發(fā)生了變化，尤其是含硫氨基酸大幅度下降，說明巰基乙酸膽堿低共熔體系能夠有效破壞二硫鍵，因此能夠高效溶解雞毛。

②利用再生雞毛角蛋白和PEG混合可以制備角蛋白多孔材料，該材料對細胞無毒，在醫(yī)用材料方面具有廣泛的應用。