陳晴，岳詩(shī)雨，張曉楠，何韶衡

過敏性疾病被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一，是當(dāng)前世界性的衛(wèi)生學(xué)問題[1]。柏樹花粉(Cypresspollen)是引起季節(jié)性過敏性疾病最常見的原因之一，國(guó)內(nèi)外對(duì)柏樹花粉致敏蛋白組分的相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果不盡相同[2]。為了減少在主要過敏原水平上引入任何可能的人工制品的風(fēng)險(xiǎn)，開發(fā)快速的提取方法，得到主要的過敏原富集物是研究的關(guān)鍵，可對(duì)當(dāng)?shù)剡^敏性性疾病進(jìn)行診斷和治療。本研究使用40 mmol/L NH4HCO3緩沖液作為提取液對(duì)柏樹花粉致敏蛋白進(jìn)行粗提取，利用離子交換層析初步純化其主要致敏蛋白Cup a 1，使用離子交換色譜和SDS-PAGE等方法對(duì)遼寧省錦州地區(qū)柏樹花粉致敏蛋白組分進(jìn)行分離、鑒定，為本地區(qū)花粉過敏的診斷及治療提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

花粉原料為中國(guó)柏樹(Cypress)花粉，2017年4月柏樹花粉季內(nèi)于遼寧省錦州市錦州醫(yī)科大學(xué)采集，采集后于-80 ℃冷凍保存。

1.2 主要儀器與試劑

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽(Bio-Rad，美國(guó))；AKTA Pure蛋白分離純化儀(GE，美國(guó))；Azure C300化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Azure，美國(guó))；Micro17R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo，美國(guó)); Cascada Ⅲ 全新智能純水/超純水一體化系統(tǒng)(Pall，美國(guó))；甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、丙烯酰胺、N, N-亞甲基二丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250、KH2PO4、NH4HCO3和十二烷基硫酸鈉(SDS)(國(guó)藥集團(tuán)，上海，中國(guó))；蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Takara生物技術(shù)有限公司，大連，中國(guó))。

1.3 柏樹花粉粗提液提取

稱量柏樹花粉1.00 g，用20 mL 4 ℃ 10 mmol/L KH2PO4快速清洗，5 000×g離心除去上清液，將花粉沉淀轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽，加入液氮快速研磨，加入20 mL 40 mmol/L NH4HCO3緩沖液將花粉轉(zhuǎn)移至50 mL燒杯中，4 ℃下攪拌過夜，在4 ℃下，20 000×g離心花粉混懸液30 min，保留上清，用0.45 μm濾器過濾上清，4 ℃保存[2]。

1.4 柏樹花粉致敏蛋白Cup a 1分離純化

結(jié)合液A：40 mmol/L NH4HCO3，洗脫液B：1 000 mmol/L NH4HCO3。首先用20%乙醇清洗系統(tǒng)泵，然后將離子交換層析柱HiTrap Q HP (1 mL，GE Healthcare)柱子連接到AKTA pure儀器上，再用結(jié)合液A清洗樣品泵。然后用5個(gè)柱體積 A平衡柱子。通過樣品泵上樣，使用20% B沖洗3個(gè)柱體積，洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，逐漸增加洗脫液B濃度40%，沖洗3個(gè)柱體積，同時(shí)收集洗脫液，最后增加洗脫液B濃度80%。

1.5 純化后柏樹花粉致敏蛋白Cup a 1鑒定

采用SDS-PAGE體系對(duì)各組分蛋白進(jìn)行分析鑒定。12%分離膠和5%濃縮膠對(duì)柏樹花粉粗提液和經(jīng)離子交換層析分離后每一份蛋白組分進(jìn)行電泳分離，電泳凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液進(jìn)行染色，脫色和用凝膠電泳成像系統(tǒng)分析并進(jìn)行圖像采集，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)后確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 柏樹花粉粗提液的SDS-PAGE

柏樹花粉粗提液中主要有20余條蛋白區(qū)帶，主帶有6條，相對(duì)分子質(zhì)量分別為70 000、45 000、43 000、36 000、24 000、17 000, 其中43 000為柏樹花粉中的主要過敏原蛋白質(zhì)。在25 000～100 000和10 000～17 000區(qū)帶內(nèi)的蛋白含量相對(duì)豐富(圖1)。

2.2 Cup a 1的分離純化

2.2.1 柏樹花粉粗提液的離子交換層析

陽(yáng)離子交換層析結(jié)果見圖2，其中Ⅲ為含目的蛋白Cup a 1的收集峰。

圖 1 柏樹花粉粗提液中主要蛋白質(zhì)分布Fig 1 SDS-PAGE of major proteins in crude extract of Cypress pollenMr:相對(duì)分子質(zhì)量；M：蛋白marker；1：40 mmol/L NH4HCO3緩沖液作為提取液

圖 2 陽(yáng)離子交換層析色譜結(jié)果Fig 2 Result of cation exchange column chromatography

2.2.2 SDS-PAGE鑒定

選擇圖2中標(biāo)注的5個(gè)收集液進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖3)，其中Lane 3對(duì)應(yīng)的Ⅲ收集液SDS-PAGE可見明顯相對(duì)分子質(zhì)量為43 000蛋白條帶，即目的蛋白Cup a 1。

圖 3 陽(yáng)離子交換層析SDS-PAGE結(jié)果Fig 3 SDS-PAGE results of cation exchange column chromatographyMr:相對(duì)分子質(zhì)量；1～5分別對(duì)應(yīng)Ⅰ～Ⅴ號(hào)收集液的蛋白條帶

3 討論

花粉過敏(pollen allergy)又稱枯草熱(pollinosis)，是致敏花粉所引起的鼻黏膜炎癥、過敏性哮喘和過敏性結(jié)膜炎等癥狀[3-4]。

柏科植物(Cupressaceae)在國(guó)內(nèi)外分布都極為廣泛，1945年最早報(bào)道人類對(duì)柏樹花粉過敏，在北美和澳大利亞，它們是造成呼吸道過敏非常重要的原因[5]。柏科花粉過敏癥的臨床數(shù)據(jù)和流行病學(xué)數(shù)據(jù)因物種和地區(qū)而有所不同。在不同種類的柏科植物系家族中，地中海柏木亞科類植物占很大一部分，并且已經(jīng)被確認(rèn)為是冬季過敏癥與日俱增的“元兇”[6]。在日本主要的花粉過敏源是日本雪松(日本柳杉)(Japanese cedar)[5]。在中國(guó)，柏樹花粉是北部沿海地區(qū)春季主要致敏花粉[7]。據(jù)報(bào)道，3月份北京協(xié)和醫(yī)院的花粉過敏患者中，60%由柏樹花粉引發(fā)，圓柏(Chinese juniper)是目前北京地區(qū)3～4月上旬造成過敏性鼻炎和結(jié)膜炎最主要的原因[8]。冬季周期性頻發(fā)的鼻炎對(duì)抗生素療法無(wú)響應(yīng)證明了臨床現(xiàn)象也很大程度上表現(xiàn)為柏樹過敏癥[9]。

柏樹花粉中主要的致敏成分是蛋白質(zhì)，對(duì)柏樹花粉過敏性提取物的表征表明，該花粉至少含有6種對(duì)IgE反應(yīng)的成分，主要為相對(duì)分子質(zhì)量43 000的糖蛋白(Cup a 1)[10]。與高碳水化合物含量相比，這些提取物中的蛋白質(zhì)含量非常低。因此，碳水化合物部分在花粉提取物中的作用是一個(gè)重要的問題，糖基可參與人IgE的結(jié)合，可能是提取物之間廣泛交叉反應(yīng)的原因[11-12]。柏樹花粉提取物目前被應(yīng)用于柏科花粉病的診斷和免疫療法，然而，商業(yè)化用于體外檢測(cè)的試劑盒常常對(duì)有癥狀的患者提供不明確或假陰性的結(jié)果，因此有必要對(duì)柏樹花粉的主要過敏原進(jìn)行分離純化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)花粉過敏患者特異性的診斷與治療[12-13]。

本研究通過對(duì)柏樹花粉粗提液中主要致敏蛋白Cup a 1分離純化，使用40 mmol/L NH4HCO3緩沖液作為提取液對(duì)柏樹花粉致敏蛋白進(jìn)行粗提取，利用離子交換層析初步純化。結(jié)果表明，使用40 mmol/L NH4HCO3進(jìn)行提取時(shí)，粗提液中Cup a 1含量最高(相對(duì)分子質(zhì)量43 000)，而其他蛋白含量較少，通過利用酸性緩沖溶液10 mmol/L KH2PO4(pH 4.3)溶液對(duì)花粉進(jìn)行快速清洗，溶解花粉中的碳水化合物，再利用堿性緩沖液40 mmol/L NH4HCO3(pH 8.0)作為提取液進(jìn)行提取過程，免除了脫鹽、透析和冷凍干燥等繁瑣過程，避免了蛋白質(zhì)的降解，其堿性低鹽的成分可以提取少量的蛋白質(zhì)，其中過敏原蛋白為提取液的主要蛋白成分。陽(yáng)離子交換層析結(jié)果，主要致敏原蛋白Cup a 1主要分布在Ⅲ峰，經(jīng)SDS-PAGE分析，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的Cup a 1相對(duì)分子質(zhì)量43 000[2]相一致。純化后的Cup a 1具有應(yīng)用于制備過敏原皮試液或脫敏制劑和提高柏樹花粉皮試陽(yáng)性率及脫敏療效的潛在價(jià)值，還有望開發(fā)成體外檢測(cè)試劑，為臨床柏樹花粉變態(tài)反應(yīng)的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。本研究利用離子交換層析對(duì)柏樹花粉粗提液進(jìn)行分離，成功純化出柏樹花粉主要致敏蛋白Cup a 1。