崔新雯，張一民，汪 贊，孔振興，蘇 浩，于晶晶

骨骼肌是人體重要的運(yùn)動(dòng)器官，骨骼肌質(zhì)量直接影響著機(jī)體的體質(zhì)健康水平。擁有絕對(duì)數(shù)量蛋白質(zhì)的骨骼肌，也是蛋白質(zhì)代謝非?；钴S的器官。作為有絲分裂后的組織，骨骼肌質(zhì)量和大小受蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，即受到蛋白合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡控制。蛋白質(zhì)的合成和降解受復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)所調(diào)控。骨骼肌蛋白合成對(duì)骨骼肌質(zhì)量的重要性不言而喻。研究發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR信號(hào)通路是調(diào)控骨骼肌蛋白合成中極為重要的環(huán)節(jié)，且運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用尤為突出。多個(gè)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白的降解，如泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）、自噬-溶酶體系統(tǒng)（autophagy-lysosomal system，ALS）（Wohlgemuth et al.，2010）。UPS主要降解肌纖維和大多數(shù)可溶性短壽命蛋白，促進(jìn)了骨骼肌重塑，并有效避免了各種刺激因素引起的有毒有害物質(zhì)的積累，但當(dāng)其活性被過度激活時(shí)，便使骨骼肌質(zhì)量朝著負(fù)增長(zhǎng)的方向發(fā)展，威脅骨骼肌健康，因而UPS活性的適宜激活對(duì)骨骼肌質(zhì)量至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可因運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間等的不同對(duì)UPS的活性產(chǎn)生不同影響。ALS主要降解細(xì)胞器和長(zhǎng)壽命蛋白，使細(xì)胞得以更新與重建（Lavandero et al.，2013；Sandri，2010）。細(xì)胞通過保持基礎(chǔ)自噬水平，去除功能失調(diào)或受損的成分，是維持細(xì)胞正常功能和質(zhì)量控制所必需的（Lee et al.，2010；Lira et al.，2013）。多項(xiàng)研究表明，運(yùn)動(dòng)引起的自噬水平的適宜激活，促成了不同生理病理?xiàng)l件下骨骼肌重塑與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，有助于防治骨骼肌減少的發(fā)生發(fā)展（Kim et al.，2016；Pigna et al.，2016；Schwalm et al.，2015a；Vainshtein et al.，2016）。但目前關(guān)于基礎(chǔ)自噬水平在骨骼肌運(yùn)動(dòng)適應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用研究不足，尚待探索。

在增齡、疾病或者不適的環(huán)境狀態(tài)下，眾多因素可通過影響骨骼肌的蛋白質(zhì)合成與降解，進(jìn)而影響骨骼肌質(zhì)量，對(duì)骨骼肌健康產(chǎn)生威脅。維持正常的骨骼肌質(zhì)量對(duì)于骨骼健康、骨骼肌健康、生活質(zhì)量，以及肌少癥的預(yù)防意義重大。身體活動(dòng)是提高骨骼肌質(zhì)量、增進(jìn)骨骼肌生理功能的重要保障，也是一種非常經(jīng)濟(jì)、有效的手段。傳統(tǒng)有氧運(yùn)動(dòng)有助于提高有氧代謝水平，在維持骨骼肌質(zhì)量和預(yù)防肌肉減少上表現(xiàn)出良好的干預(yù)效果（Harber et al.，2009，2012；Morris et al.，2013），但在實(shí)際運(yùn)用中，因其運(yùn)動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)、動(dòng)作單調(diào)、易使人感到枯燥等特點(diǎn)，并不易于被大眾廣泛接受。因而，優(yōu)化運(yùn)動(dòng)方式顯得更為重要。

高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（high-intensity interval training，HIIT）是一種相對(duì)于中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)的訓(xùn)練方式，其特點(diǎn)是進(jìn)行多次持續(xù)時(shí)間為幾秒到幾分鐘的高強(qiáng)度練習(xí)，期間穿插靜息或低強(qiáng)度練習(xí)以形成間歇期，使練習(xí)者不能得到完全恢復(fù)（黎涌明，2015；Billat，2001）。在進(jìn)行HIIT時(shí)，受試者可以得到多次重復(fù)的高強(qiáng)度刺激，采用較少的運(yùn)動(dòng)時(shí)間即可同時(shí)提高有氧和無氧代謝能力（Gibala et al.，2008）。此外，HIIT在改善體脂的含量與分布、控制血糖血脂、提高胰島素敏感性，及改善血管內(nèi)皮功能上，都產(chǎn)生了積極的干預(yù)效果（王京京等，2015）。不僅如此，與傳統(tǒng)中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練（moderate intensity continuous training，MICT）相比，HIIT具有更高的運(yùn)動(dòng)愉悅感和訓(xùn)練依從性，這使HIIT顯示出明顯的經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性等優(yōu)勢(shì)（Heinrich et al.，2014）。一些以80%～90%最大攝氧量（O2max）為運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，重復(fù)4～5次，每次2～4 min的HIIT的研究發(fā)現(xiàn)，無論對(duì)無鍛煉經(jīng)歷的大眾、高齡人群，還是慢性病患者，HIIT均產(chǎn)生了可觀的應(yīng)用價(jià)值，而對(duì)其兼顧安全性和鍛煉效果的進(jìn)一步探索吸引了眾多學(xué)者的研究興趣（Holloway et al.，2015；Nybo et al.，2010）。

HIIT除了可以提高骨骼肌有氧和無氧代謝能力，其對(duì)骨骼肌質(zhì)量有何影響？決定骨骼肌質(zhì)量的蛋白合成與降解在HIIT的作用下是否產(chǎn)生適應(yīng)性變化？該變化的調(diào)節(jié)機(jī)制為何？這與傳統(tǒng)的MICT相比有何異同？這些問題都亟待進(jìn)一步研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

24只9月齡雄性Wistar大鼠，體重608.71±72.80 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]，于北京體育大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，相對(duì)濕度55%～70%，溫度22℃～24℃，晝夜明暗交替各12 h。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3～5只，自由飲水、攝食。大鼠隨機(jī)分為：安靜對(duì)照組（C組）、MICT運(yùn)動(dòng)組（M組）和HIIT運(yùn)動(dòng)組（H組），每組8只。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物使用通過了北京體育大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。

1.2 訓(xùn)練方案

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，進(jìn)行1周的適應(yīng)性訓(xùn)練，每天15～20 min，跑臺(tái)速度為10 m/min，坡度為0°。之后，進(jìn)行為期12周的正式運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。C組大鼠正常飲食生活，無運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。M組和H組大鼠的訓(xùn)練時(shí)間為每周一至周五下午14：00—16：00。MICT和HIIT方案見表1和表2，跑臺(tái)坡度均為10°，每周訓(xùn)練5次。該方案結(jié)合Bedford等（Bedford et al.，1979）的研究、心衰患者的研究（Angadi et al.，2015；Arena et al.，2013；Smart et al.，2013）及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最終確定。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度根據(jù)大鼠在訓(xùn)練前、訓(xùn)練4周后、8周后所測(cè)得的O2max所對(duì)應(yīng)的跑速的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度百分比而控制。

表1 MICT方案Table 1 The Protocol of MICT

表2 HIIT方案Table 2 The Protocol of HIIT

1.3 樣本采集與保存

所有大鼠在末次運(yùn)動(dòng)結(jié)束24 h后進(jìn)行取材，以5%水合氯醛1 ml/100 g體重對(duì)大鼠腹腔注射進(jìn)行麻醉。剝離左側(cè)比目魚肌，用電子秤稱量肌肉濕重。剝離右側(cè)比目魚肌，取肌腹截面1×1×1 mm大小投入預(yù)冷的2.5%的戊二醛中，隨后4℃存放，以備超薄切片的制作。取50 mg肌腹用錫紙包裹投入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存，以備蛋白相對(duì)含量的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.4.2 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot）檢測(cè)

取出在-80℃保存的每只大鼠比目魚肌各50 mg，分別迅速投入預(yù)先加好磷酸酶抑制劑（04906837001，Roche）的RIPA裂解液（R0278，Sigma）EP管中，冰浴勻漿20 s 3次。靜置30 min后，4℃，12 000 rpm離心5 min取上清。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（23227，Thermo Scientific）測(cè)定所有樣品的蛋白濃度，加入相應(yīng)比例的（4×）裂解液和上樣緩沖液（NP0007，Invitrogen），將蛋白濃度調(diào)為一致，70℃變性10 min。SDS-PAGE（NP0342BOX，Invitrogen）凝膠電泳200 V，45 min，300 mA轉(zhuǎn)膜1.5～2 h，配置5%的脫脂牛奶對(duì)PVDF膜（IPVH00010，Immobilon-P）封閉0.5～1 h，使用 5% BSA配制一抗 Akt、mTOR、P70 S6K、4EBP1、Ubiquitin、MuRF-1、MAFbx、Beclin 1、LC3、P62、ULK1、COXIV 、PGC-1α和GAPDH，4℃過夜，搖床孵育。次日洗膜后，二抗室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后將條帶置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDoc Touch Imaging System，Bio-Rad），滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑（34095，Thermo Scientific）進(jìn)行曝光顯影，利用Image Lab 5.1軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 透射電子顯微鏡觀察自噬體形態(tài)結(jié)構(gòu)

電鏡超薄切片的制作按如下步驟進(jìn)行：1）取出固定于2.5%戊二醛中的標(biāo)本；2）磷酸緩沖液浸洗3次，每次10 min；3）置于四氧化鋨固定液4℃固定2 h；4）雙蒸水沖洗3次，每次10 min；5）乙醇梯度脫水：50%～70%～90%各10 min；6）100% 乙醇脫水 2次，每次15 min；7）環(huán)氧丙烷置換2次，每次10 min；8）1：1的環(huán)氧丙烷和樹脂浸透，室溫1 h；9）1：4的環(huán)氧丙烷和樹脂浸透，室溫1 h；10）純樹脂浸透，室溫 2 h；11）純樹脂包埋；12）聚合、修塊；13）制作1 μm厚度的半薄切片，天青-美蘭染色，光鏡下定位觀察；14）制作700 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛染色。之后，透射電子顯微鏡觀察，透射電鏡特殊成像系統(tǒng)（CCD）拍照。各組隨機(jī)觀察40個(gè)視野（×2 000）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

使用SPSS 19.0、GraphPad Prism 5進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析，事后比較采用Bonfferonni校正，以P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HIIT對(duì)中年大鼠骨骼肌濕重的影響

采用協(xié)方差分析訓(xùn)練對(duì)中年大鼠比目魚肌濕重的影響，以體重為協(xié)變量，在體重=610.4 g時(shí)評(píng)估不同組間比目魚肌濕重的差別，發(fā)現(xiàn)與C組（0.28±0.03 g）相比，M組（0.31±0.04 g，P=0.036）和H 組（0.30±0.03 g，P=0.040）比目魚肌的濕重均提高。

2.2 HIIT對(duì)中年大鼠骨骼肌蛋白合成的影響

Western blot檢 測(cè) AktSer473、mTORSer2448、P70 S6KThr389、4E-BP1Thr37/46的蛋白表達(dá)，采用單因素分析HIIT對(duì)中年大鼠比目魚肌蛋白合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比C組，H組的mTORSer2448/mTOR比值提高了26%（P=0.049）；M組P70 S6KThr389/P70 S6K比值提高了40%（P=0.028），H組 P70 S6KThr389和P70 S6KThr389/P70 S6K比值提高了70%（P=0.001）；訓(xùn)練對(duì)AktSer473和4E-BP1Thr37/46的磷酸化蛋白表達(dá)無明顯差異（P＞0.05，圖1）。

圖1 訓(xùn)練對(duì)比目魚肌蛋白合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 1. Effects of Training on the Expression of Protein Synthesis Related Proteins

2.3 HIIT對(duì)中年大鼠骨骼肌蛋白降解的影響

通過檢測(cè)泛素化蛋白和兩個(gè)肌肉特異性E3泛素連接酶MuRF-1和MAFbx的蛋白表達(dá)，分析HIIT對(duì)中年大鼠趾長(zhǎng)伸肌泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的影響。結(jié)果顯示，相比C組，MICT和HIIT沒有對(duì)泛素化蛋白和MuRF-1蛋白含量產(chǎn)生明顯影響（P＞0.05），但對(duì)MAFbx的蛋白表達(dá)有降低的趨勢(shì)，均為20%（P=0.058，P=0.052，圖2）。

圖2 訓(xùn)練對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)關(guān)鍵組分的影響Figure 2. Effects of Training on the Expression of Ubiquitin-proteasome System Related Proteins

通過電鏡觀察自噬體，發(fā)現(xiàn)C組肌原纖維中可見散在分布的自噬體，而H組和M組可見較多處于后期降解階段的自噬體，且線粒體增多、聚集（圖3）。通過western blot檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，相比C組，M組和H組的LC3II蛋白表達(dá)分別提高了88%（P=0.000）和64%（P=0.004），H組COXIV蛋白表達(dá)提高了56%（P=0.024）。但訓(xùn)練對(duì)LC3II/LC3I、P62、ULK1Ser757/ULK1比值、Beclin-1和PGC-1α的表達(dá)均沒有顯著影響（圖4）。

圖3 訓(xùn)練對(duì)自噬體形成的影響Figure 3. Effects of Training on the Formation of Autophagosomes

圖4 訓(xùn)練對(duì)自噬-溶酶體系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4. Effects of Training on the Expression ofAutophagy Related Proteins

3 分析與討論

探索連續(xù)12周的HIIT對(duì)中年大鼠比目魚肌濕重、蛋白合成和降解相關(guān)蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)HIIT可能通過促進(jìn)比目魚肌蛋白合成、降低MAFbx蛋白表達(dá)和提高細(xì)胞自噬活性，促進(jìn)比目魚肌質(zhì)量的提高。

骨骼肌質(zhì)量是機(jī)體健康的基石，防止或延緩骨骼肌質(zhì)量的丟失，使其維持較高的水平對(duì)骨骼肌健康至關(guān)重要。運(yùn)動(dòng)作為一種經(jīng)濟(jì)有效的干預(yù)手段已得到了廣泛認(rèn)可。研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以有效緩解老年骨骼肌質(zhì)量的丟失（Betik et al.，2008；Kim et al.，2013）。而Betik等（2009）的研究指出，有氧運(yùn)動(dòng)并不足以抵抗衰老導(dǎo)致的骨骼肌質(zhì)量和功能的下降，老年骨骼肌的運(yùn)動(dòng)可塑性降低。這部分說明，衰老骨骼肌可能對(duì)有氧運(yùn)動(dòng)的敏感性下降，由訓(xùn)練產(chǎn)生的抗衰老效果減弱了。本研究將關(guān)注對(duì)象的年齡提前，探索了有氧訓(xùn)練對(duì)中年大鼠骨骼肌質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期HIIT提高了中年大鼠比目魚肌質(zhì)量，這間接反映了中年時(shí)期骨骼肌質(zhì)量有較高的可塑性，以該時(shí)期作為切入點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)或?qū)a(chǎn)生較大效果。

Akt是一種絲/蘇氨酸激酶，是雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的重要調(diào)節(jié)者。mTOR參與了蛋白翻譯的啟動(dòng)，其中Ser2448位點(diǎn)的磷酸化被認(rèn)為是mTOR活性激活的標(biāo)志（Bolster et al.，2002），一旦被激活，mTOR可以通過下游的效應(yīng)蛋白：核糖體蛋白S6蛋白激酶（P70 S6K）和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）的抑制蛋白 4EBP1，提高翻譯起始效率（Pause et al.，1994）。本研究發(fā)現(xiàn)，HIIT訓(xùn)練后mTOR和P70 S6K蛋白的磷酸化水平提高，而Akt則無明顯變化，推測(cè)可能存在有非Akt依賴的蛋白合成信號(hào)通路（Hornberger et al.，2004；Pallafacchina et al.，2002）。實(shí)際上，Akt在生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)的蛋白合成信號(hào)通路中是必須的，而機(jī)械刺激則可以通過非Akt依賴的途徑誘導(dǎo)mTOR依賴的蛋白合成。研究發(fā)現(xiàn)，在耐力運(yùn)動(dòng)的恢復(fù)期，Akt沒有發(fā)生改變（Nader et al.，2001），而mTOR、P70 S6K、4E-BP1、eEF2和S6等蛋白的磷酸化水平普遍提高（Mascher et al.，2007；Mascher et al.，2011）。推測(cè)耐力運(yùn)動(dòng)后對(duì)蛋白合成的調(diào)節(jié)信號(hào)主要匯集于mTOR。Goodman等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，通過過表達(dá)小分子GTP酶Rheb（ras homologue enriched in brain，Rheb）可促使mTOR通過非Akt依賴的信號(hào)途徑調(diào)節(jié)蛋白合成，誘導(dǎo)骨骼肌肥大適應(yīng)，彌補(bǔ)了骨骼肌質(zhì)量控制的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。

相比傳統(tǒng)MICT，HIIT在促進(jìn)比目魚肌mTOR信號(hào)通路蛋白的磷酸化表達(dá)上作用更明顯，這可能是由于HIIT提供的是變換負(fù)荷，相比MICT的恒定負(fù)荷，能夠動(dòng)員更多肌纖維。同時(shí)，HIIT由高低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組成，而這些脈沖式的高強(qiáng)度的肌肉收縮活動(dòng)，放大了mTOR分子信號(hào)通路的激活效應(yīng)，成為促成骨骼肌蛋白合成率的關(guān)鍵因素（Witard et al.，2016）。然而，雖然HIIT可以提高骨骼肌蛋白合成，但不可否認(rèn)的是，與只接受抗阻訓(xùn)練相比，有氧運(yùn)動(dòng)+抗阻運(yùn)動(dòng)或HIIT+抗阻運(yùn)動(dòng)使骨骼肌的蛋白合成反應(yīng)減弱（Fernandez-Gonzalo et al.，2013；Fyfe et al.，2018），因此單純以促進(jìn)肌肉肥大為目的的訓(xùn)練方式，抗阻運(yùn)動(dòng)為最佳。但是結(jié)合HIIT的其他健身效果，例如，提高有氧、無氧工作能力，及較高的運(yùn)動(dòng)愉悅性，HIIT值得大力推廣。

研究發(fā)現(xiàn)，一次離心運(yùn)動(dòng)（Stupka et al.，2001）或大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（Zhu，2014）所引起的肌肉損傷與泛素化蛋白增多、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的過度激活有關(guān)，而在長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)適應(yīng)下，泛素化蛋白含量的增加減弱，蛋白降解有所緩和。本研究發(fā)現(xiàn)，HIIT和MICT并沒有使比目魚肌泛素化蛋白明顯變化，這個(gè)結(jié)果和前人的研究發(fā)現(xiàn)一致（Cunha et al.，2012；Jamart et al.，2012）。實(shí)際上，泛素化蛋白水平在特定時(shí)間內(nèi)反映了蛋白泛素化過程和泛素化蛋白降解過程間的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)?shù)鞍追核鼗^程和泛素化蛋白降解過程共同提高或減少時(shí)，泛素化蛋白的波動(dòng)并不會(huì)很大。本研究結(jié)果說明，運(yùn)動(dòng)可能對(duì)蛋白泛素化過程和泛素化蛋白降解過程起到了同向作用，因而沒有影響細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白水平。MuRF-1和MAFbx是兩個(gè)肌肉特異性的E3泛素連接酶（Rom et al.，2016），它們催化泛素與靶蛋白結(jié)合，在肌肉泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解途徑中有著重要作用。當(dāng)骨骼肌中MuRF-1和/或MAFbx的表達(dá)增加時(shí)，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能亢進(jìn)，促進(jìn)對(duì)MuRF-1和/或MAFbx底物蛋白的降解過程（Altun et al.，2010；Clavel et al.，2006）。研究表明，有氧訓(xùn)練可以通過降低蛋白降解標(biāo)志蛋白MAFbx和MuRF-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制泛素-蛋白酶體途徑的蛋白降解，且在對(duì)抗骨骼肌減少的應(yīng)用上取得了良好效果（Chen et al.，2011；Fernandez-Gonzalo et al.，2013；Vechetti-Junior et al.，2016）。而目前有關(guān)HIIT對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)影響的研究少有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，12周的HIIT降低了比目魚肌MAFbx的蛋白表達(dá)，且與MICT的效果相當(dāng)，推測(cè)MAFbx對(duì)不同形式有氧訓(xùn)練的反應(yīng)敏感性差別不大。

運(yùn)動(dòng)后骨骼肌良性適應(yīng)的重要機(jī)制之一就是細(xì)胞自噬適宜水平的激活。本實(shí)驗(yàn)研究了HIIT和MICT對(duì)骨骼肌細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平影響。首先采用電鏡觀察各組大鼠比目魚肌纖維的超微結(jié)構(gòu)及自噬體的產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)M組和H組自噬體和線粒體多于安靜對(duì)照組，這一結(jié)果與馬曉雯等（2016）有關(guān)長(zhǎng)期中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞自噬影響的電鏡結(jié)果相一致，但沒有出現(xiàn)該研究發(fā)現(xiàn)的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌自噬的過度激活，致使心肌纖維嚴(yán)重受損的情況。在對(duì)自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，M組和H組均顯著提高了比目魚肌LC3II的蛋白含量，且產(chǎn)生提高LC3II/LC3I比值的趨勢(shì)。說明本實(shí)驗(yàn)條件下HIIT有效激活了基礎(chǔ)細(xì)胞自噬的適宜活性，且與MICT效果相當(dāng)。適宜的細(xì)胞自噬水平，可使細(xì)胞內(nèi)受損或老化的細(xì)胞器被及時(shí)清除，同時(shí)細(xì)胞可以得到更多的能源物質(zhì)，這對(duì)骨骼肌質(zhì)量和功能的維持和提高有極為重要的意義。為進(jìn)一步探索調(diào)節(jié)HIIT誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬活性改變的信號(hào)通路，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了經(jīng)典的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)信號(hào)：mTORC1和Beclin-1的相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)。mTORC1可以通過去磷酸化ULK1Ser757，以激活ULK1復(fù)合體，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬下游信號(hào)。Beclin-1在自噬體形成初期發(fā)揮重要作用，主要調(diào)控其他自噬相關(guān)基因蛋白在自噬體膜的定位。本研究發(fā)現(xiàn)，HIIT無論對(duì)mTORSer2448、ULK1Ser757磷酸化水平還是Beclin-1的蛋白表達(dá)均無顯著影響，這與反應(yīng)細(xì)胞自噬活性的LC3II蛋白變化不一致。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在Schwalm等（2015b）、Kim等（2013）以及Jamart等（2013）的研究中。推測(cè)長(zhǎng)期HIIT誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平的提高可能受到非mTOR依賴和非Beclin-1依賴的信號(hào)通路調(diào)節(jié)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HIIT明顯提高了線粒體含量標(biāo)志物COX的蛋白表達(dá)，MICT表現(xiàn)出一定的提高趨勢(shì)。COX是調(diào)控線粒體氧化磷酸化水平的線粒體呼吸鏈末端的酶復(fù)合體，僅在線粒體中有表達(dá)，其表達(dá)水平可一定程度反映線粒體的含量。結(jié)合本研究電鏡下所見線粒體的增多、聚集，這或許提示，HIIT對(duì)基礎(chǔ)細(xì)胞自噬水平的提高與線粒體適應(yīng)性增加存在某種聯(lián)系。相比MICT，HIIT的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)氧氣的需要量更大，可能促成了對(duì)線粒體生物合成更深刻的刺激。

并非所有研究結(jié)果均支持長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)適應(yīng)提高骨骼肌細(xì)胞自噬活性，Kwon等（2017）發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期抗阻訓(xùn)練（8周）抑制了細(xì)胞自噬誘導(dǎo)的蛋白降解，研究結(jié)果的不一致性可能與訓(xùn)練手段（抗阻訓(xùn)練vs.有氧訓(xùn)練）及研究對(duì)象年齡（14周齡vs.9月齡）不同有關(guān)?？棺栌?xùn)練對(duì)線粒體的影響較小，而有氧訓(xùn)練可以通過同時(shí)提高線粒體自噬和線粒體生物合成作用以促進(jìn)線粒體周轉(zhuǎn)，因而激活了基礎(chǔ)自噬水平。此外，本研究對(duì)象為中年大鼠，相比年輕大鼠，有更多的受損細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊蛋白需要通過提高自噬活性來加速清理，這也是有氧訓(xùn)練誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平提高的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR蛋白合成信號(hào)通路和UPS、ALS的骨骼肌蛋白降解系統(tǒng)均發(fā)生了適應(yīng)性變化，它們之間相互作用，共同控制著細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)比目魚肌蛋白的合成和降解，最終決定比目魚肌的質(zhì)量水平。本研究提示，長(zhǎng)期HIIT提高了比目魚肌蛋白合成，激活了細(xì)胞自噬活性，總體以蛋白合成占優(yōu)勢(shì)，可能是HIIT提高比目魚肌質(zhì)量的重要機(jī)制，且HIIT與傳統(tǒng)MCIT效果相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)以II型肌纖維為主的趾長(zhǎng)伸肌也進(jìn)行了類似研究（崔新雯等，2019），同樣發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期HIIT可以提高中年大鼠趾長(zhǎng)伸肌質(zhì)量，但對(duì)有關(guān)趾長(zhǎng)伸肌蛋白合成和蛋白降解的調(diào)控機(jī)制與本研究以I型肌纖維為主的比目魚肌的有所不同（如與趾長(zhǎng)伸肌相比，比目魚肌對(duì)HIIT誘導(dǎo)的蛋白合成的反應(yīng)更強(qiáng)烈，自噬流通暢性的反應(yīng)較微弱）。這在某種程度上體現(xiàn)了不同肌纖維類型的特異性反應(yīng)，也共同說明了HIIT對(duì)骨骼肌質(zhì)量的積極作用。

4 結(jié)論

HIIT促進(jìn)了中年大鼠比目魚肌質(zhì)量的提高，可能是骨骼肌蛋白合成與降解共同作用的結(jié)果，即促進(jìn)了比目魚肌蛋白合成，降低MAFbx的蛋白表達(dá)，以及激活了基礎(chǔ)水平的細(xì)胞自噬活性。HIIT或?qū)⒊蔀檠泳徆趋兰∷ダ系倪\(yùn)動(dòng)干預(yù)新策略。