歐陽(yáng)昕，徐優(yōu)慧，陳明人，肖愛(ài)嬌△

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）是指圍產(chǎn)期內(nèi)各種因素引起的缺氧和（或）缺血導(dǎo)致的腦損傷［1］。該病發(fā)病率較高，在發(fā)達(dá)國(guó)家約為0.15%，在發(fā)展中國(guó)家為1%～2%［2］，同時(shí)具有高致殘率和死亡率的特點(diǎn)［3］。艾灸作為中醫(yī)療法的重要組成部分，在治療急性腦卒中方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)和特色，并取得了一定療效［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)艾灸能明顯減輕成年大鼠腦缺血再灌注損傷［5?6］，為艾灸治療HIE提供了新思路。細(xì)胞凋亡參與了HIE的發(fā)病過(guò)程［7］，其中caspase?9、caspase?3分別是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)、執(zhí)行的關(guān)鍵因子。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)HIE小鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加［8?10］。艾灸能否通過(guò)減少腦細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕新生小鼠HIE尚不明確。本研究通過(guò)建立新生小鼠HIE模型，觀察艾灸對(duì)小鼠腦組織細(xì)胞凋亡、caspase?9和caspase?3表達(dá)的影響，以探討艾灸對(duì)新生小鼠HIE的抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級(jí)健康成年ICR小鼠12只，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心［SYXK（贛）2017?0004］。按雌鼠∶雄鼠=3∶1合籠，雌鼠孕期為21 d，待其自然分娩，小鼠出生當(dāng)日計(jì)為P0，使用P7（出生后第7天）新生小鼠55只（不限雌雄）。主要試劑與儀器：凋亡原位檢測(cè)試劑盒（Millipore），兔抗小鼠caspase?9（Cell Signaling Technology），A11011山羊抗兔IgG（Invitrogen），caspase?3放射免疫檢測(cè)試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所），CM1950冰凍切片機(jī)和Leica2000熒光顯微鏡及圖像分析軟件（Leica），XH?6020全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀（西安核儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備將所有新生鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組，17只）、模型組（HI組，21只）和艾灸組（MOX組，17只）。Sham組僅行頸部手術(shù)，不做缺血、缺氧處理。HI組閉合右側(cè)頸總動(dòng)脈造成缺血，并置于缺氧箱進(jìn)行缺氧處理。參照Rice等［11?12］的方法，結(jié)合本課題實(shí)際情況，8%O2處理100 min建立HIE模型。MOX組造模方法同HI組，并于缺氧后行艾灸治療。

1.2.2 治療方法MOX組施以艾灸療法：用長(zhǎng)15 cm、直徑4 mm的艾條距大椎穴20 mm處懸灸，該穴定位參照文獻(xiàn)［13］。首次治療于造模后2 h進(jìn)行，35 min/次，1次/d，連續(xù)治療3 d。

1.2.3 腦組織形態(tài)學(xué)觀察于術(shù)后3 d，各組分別取3只鼠給予4%異氟烷吸入麻醉后迅速取腦，拍照，隨后置于30%多聚甲醛蔗糖液中固定、脫水；待下沉后將腦取出，用PBS清洗后行冰凍切片，厚度35μm，最后將所有切片置于保護(hù)液中備用。使用時(shí)，隨機(jī)從每個(gè)樣本中抽取2片腦片，用含DAPI的封片劑封片后顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 TUNEL染色檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡動(dòng)物數(shù)量和取材方法同1.2.3。從保護(hù)液中抽取腦片，每個(gè)樣本取2片，PBS清洗后末端脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶（TdT）工作液于37℃孵育1 h，加入終止液；PBS清洗后加入羅丹明標(biāo)記物，室溫下放置30 min，PBS清洗，含DAPI的封片劑封片。TUNEL染色后使用熒光顯微鏡觀察并拍照。Image J軟件計(jì)數(shù)400倍視野下的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 腦組織caspase?9陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)動(dòng)物數(shù)量和取材方法同1.2.3。從保護(hù)液中抽取腦片，每個(gè)樣本取2片，PBS漂洗后山羊血清封閉，加入兔抗小鼠caspase 9一抗（1∶500，陰性對(duì)照不加一抗，用PBS代替）于4℃孵育過(guò)夜；次日PBS清洗，加入山羊抗兔二抗（1∶500）于室溫下避光孵育1 h，PBS清洗，含DAPI的封片劑封片。免疫熒光染色后熒光顯微鏡觀察、拍照。Image J軟件計(jì)數(shù)整個(gè)200倍視野下的caspase?9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 腦組織caspase?3含量檢測(cè)于術(shù)后3 d，各組分別取8只鼠進(jìn)行腦組織caspase?3含量檢測(cè)。給予小鼠異氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取腦，分離患側(cè)大腦半球，勻漿后采用放射免疫分析法測(cè)定腦組織總蛋白和caspase?3含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析用Graphprism 5.01軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠腦組織形態(tài)學(xué)改變

2.1.1 大體觀察Sham組腦組織紅潤(rùn)，腦溝及腦回清晰，未出現(xiàn)梗死灶；HI組右半球見(jiàn)大面積梗死灶，腦組織液化、壞死，腦溝、腦回消失；MOX組右半球可見(jiàn)小面積梗死灶，腦溝變淺、腦回變寬，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Gross brain morphological structure in three groups圖1 小鼠腦大體形態(tài)

2.1.2 鏡下觀察Sham組右側(cè)腦組織排列致密，腦細(xì)胞無(wú)明顯脫落；HI組患側(cè)腦組織排列疏松，腦細(xì)胞脫落甚多；MOX組患側(cè)腦組織排列較致密，腦細(xì)胞脫落較少，見(jiàn)圖2。

2.2 3組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，與Sham組相比，HI組腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多；與HI組相比，MOX組腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，見(jiàn)圖3、4。

Fig.4 Comparison of the TUNEL?positive cells in brain tissues between three groups圖4 各組小鼠腦組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

2.3 3組小鼠腦組織caspase?9表達(dá)情況caspase?9陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，與Sham組相比，HI組腦組織caspase?9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多；與HI組相比，MOX組腦組織caspase?9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），見(jiàn)圖5、6。

Fig.6 Comparison of the expression of caspase?9 in brain tissues between three groups圖6 各組小鼠腦組織caspase?9表達(dá)水平比較

2.4 3組小鼠腦組織caspase?3含量比較HI組和Sham組腦組織caspase?3含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MOX組caspase?3含量明顯低于HI組，見(jiàn)圖7。

3 討論

針對(duì)新生兒HIE的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用低溫療法［14］、高壓氧療法［15］等，但都存在一定的局限性。低溫療法是目前唯一被循證醫(yī)學(xué)證實(shí)有效治療HIE的方法，具有降低病死率和致殘率、改善神經(jīng)癥狀等優(yōu)勢(shì)［16］，許多發(fā)達(dá)國(guó)家的新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房（NICU）已將其作為治療新生兒HIE的常規(guī)方法。但是針對(duì)足月小樣兒以及早產(chǎn)兒，低溫療法的效果并不明顯［17］，且接受低溫治療的患兒中仍有40%～50%死亡或伴有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常［18］，受益的患者僅占1/6［19］。而高壓氧療法在治療新生兒HIE則會(huì)出現(xiàn)晶體后纖維增生等不良反應(yīng)［20］。

Fig.7 Comparison of the content of caspase?3 of brain tissues between three groups圖7 各組小鼠腦組織caspase?3含量比較

為了克服現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療新生兒HIE的局限，本課題組在中醫(yī)療法方面進(jìn)行了探索。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)素有病變?cè)谀X，首取督脈之說(shuō)。大椎穴為督脈上的要穴，且具有調(diào)節(jié)手足陽(yáng)經(jīng)氣血和補(bǔ)益腦髓等作用。因此，筆者選取大椎穴對(duì)HIE新生小鼠進(jìn)行艾灸治療，發(fā)現(xiàn)艾灸大椎穴可以縮小新生小鼠HIE后的腦梗死灶、減輕缺氧缺血性腦損傷。然而，艾灸減輕缺氧缺血性腦損傷的作用機(jī)制尚不明確。

新生兒HIE的發(fā)病機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等方面［21］。其中，細(xì)胞凋亡在新生兒HIE的發(fā)病過(guò)程中起重要作用［7］，尤其在未成熟腦中作用更明顯［22］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HIE小鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加［8?9］。本研究也得到了類似的結(jié)果，通過(guò)艾灸治療后腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)較HI組明顯減少，提示艾灸可能通過(guò)減少細(xì)胞凋亡達(dá)到減輕缺氧缺血性腦損傷的目的。

細(xì)胞凋亡由復(fù)雜的胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)組成，Bcl?2家族、caspase家族等都與細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)。其中，caspase家族自始至終貫穿細(xì)胞凋亡的整個(gè)過(guò)程，其既是啟動(dòng)者，又是調(diào)控者，更是執(zhí)行者［23］。細(xì)胞凋亡主要有內(nèi)源性途徑（又稱線粒體依賴性凋亡通路）和外源性途徑（也稱死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路）兩種［24］。其中線粒體介導(dǎo)的調(diào)亡在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程中起關(guān)鍵作用［25］。當(dāng)細(xì)胞受刺激后，細(xì)胞色素C（Cyt C）從線粒體膜間隙釋放到細(xì)胞質(zhì)中，然后與細(xì)胞凋亡激活因子1（Apaf?1）結(jié)合，接著活 化caspase?9前 體?；?化 后 的caspase?9激 活caspase?3，后者執(zhí)行凋亡過(guò)程，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［26］。本研究結(jié)果顯示，與HI組相比，MOX組小鼠腦組織中caspase?9和caspase?3表達(dá)水平明顯下降，提示艾灸可能通過(guò)降低腦組織caspase?9和caspase?3表達(dá)水平，從而減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，艾灸可能通過(guò)降低caspase?9和caspase?3表達(dá)水平、減少細(xì)胞凋亡而達(dá)到減輕新生小鼠HIE。目前針對(duì)艾灸治療新生兒HIE機(jī)制的研究較少，本研究為深入探究艾灸治療新生兒HIE的作用機(jī)制提供了可借鑒的依據(jù)。

Fig.2 Results of DAPI staining of brain sections in three groups(×400)圖2各組小鼠腦組織切片DAPI染色結(jié)果（×400）

Fig.3 Results of TUNEL staining of brain tissues in three groups(×400)圖3各組小鼠腦組織TUNEL染色結(jié)果（×400）

Fig.5 Results of caspase-9 expression detected in brain tissues in three groups(immunofluorescent staining,×200)圖5各組小鼠腦組織caspase-9表達(dá)結(jié)果（免疫熒光染色，×200）