彭艷輝，段智，李濤△

慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）發(fā)源于造血干細胞，是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤［1］。CML的主要特點在于特征性斷點簇區(qū)域?c?abl癌 基 因1（breakpoint cluster region?c?abl oncogene 1，BCR?ABL）融合基因的形成，約90%的CML患者存在9號和22號染色體易位形成的BCR?ABL融合基因［1?2］。其表達的BCR?ABL融合蛋白作為一種酪氨酸激酶持續(xù)性激活下游增殖、分化等相關信號通路，從而導致疾病的惡化［2］。針對CML的治療主要應用酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI），然而TKI對部分患者的治療效果不明顯［1］，進一步探索治療CML的藥物具有非常重要的臨床意義。木犀草素（luteolin）為黃酮類化合物，是一種來源于植物的生物活性成分，具有抗氧化［3］、抗炎［4］、抗過敏［5］等多種生物學作用。作為傳統(tǒng)的中草藥成分之一，木犀草素在膀胱癌［6］、乳腺癌［7］、結腸癌［8］等癌癥中均顯示出抗腫瘤功效。然而，有關木犀草素在白血病中作用的研究尚少見。本研究旨在探討木犀草素對CML K562細胞的作用及其潛在機制，為白血病藥物篩選提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器木犀草素、Annexin V?PE/7ADD凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青?鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司，二甲基亞砜（DMSO）、CCK?8增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗B細胞淋巴瘤2蛋白（B?cell lymphoma?2，Bcl?2）、Bcl?2相關X蛋白（Bcl?2?associated X protein，Bax）、多 聚ADP核 糖 聚 合 酶（Poly ADP?ribose polymerase，PARP）、裂解的多聚ADP核糖聚合酶（Cleaved?poly ADP?ribose polymerase，Cleaved?PARP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase3）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved?Caspase3）、蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）、磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated?protein kinase B，p?AKT）、斷 裂點 簇 區(qū) 蛋 白（Breakpoint cluster region，BCR）、c?abl癌基因1（c?ABL）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；鼠抗β?肌動蛋白（β?actin）抗體購自上海碧云天生物技術有限公司；對應的羊抗兔、羊抗鼠酶標二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。細胞培養(yǎng)箱（311型）、多功能酶標儀（JS?THERMO Varioskan Flash）、蛋白電泳儀（EI0001）購自美國Thermo Scientific公司；凝膠成像系統(tǒng)（FluorChem Q）購自美國ProteinSimple公司；流式細胞分析儀（MoFlo XDP）購自美國Beckman公司。

1.2 細胞培養(yǎng)CML K562細胞購自南京科佰生物科技有限公司，培養(yǎng)于含10%FBS、1%青?鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至融合度80%～90%時進行傳代。選取生長良好且處于對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 CCK?8法測定細胞增殖情況取對數(shù)生長期K562細胞鋪板于96孔板中，細胞密度為2×105個/孔。實驗設木犀草素0、10、25、50、100μmol/L組，將木犀草素溶于DMSO配制為1 000μmol/L溶液，根據(jù)細胞培養(yǎng)時培養(yǎng)基的量分別加入不同量的木犀草素溶液使培養(yǎng)基木犀草素終濃度分別為10、25、50、100μmol/L，0μmol/L組僅加入DMSO，每種濃度設3個復孔。分別在細胞培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10μL CCK?8溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h，以酶標儀450 nm處測定細胞吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率（%）=（對照孔A450?實驗孔A450）/對照孔A450×100%。

1.4 流式細胞術測定細胞凋亡情況取對數(shù)生長期K562細胞加入6孔板中，細胞密度為1×106個/mL。實驗設木犀草素0、25、50μmol/L組，每種濃度設3個復孔。培養(yǎng)48 h后收集細胞，加PBS 350×g離心5 min，洗滌細胞，棄上清。用Binding buffer重懸細胞，調(diào)整細胞懸液體積至1 mL，取100 μL重懸液分別加入5μL 7AAD和5μL Annexin V熒光染料，孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 Western blot檢 測Bax、Bcl?2、PARP、Cleaved?PARP、Caspase3、Cleaved?Caspase3、AKT、p?AKT、BCR、c?ABL、BCR?ABL蛋白的表達將K562細胞接種于培養(yǎng)皿中，待細胞處于對數(shù)生長期，細胞密度80%時，在不同培養(yǎng)皿中加入木犀草素，調(diào)整終濃度分別為0、10、50、100μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后350×g離心5 min，收集細胞，加入細胞裂解液冰上裂解收集細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。分別取不同濃度木犀草素處理后的蛋白80μg，行SDS?PAGE電泳2～2.5 h，轉膜2 h將蛋白轉至NC膜上，5%TBST配制的脫脂牛奶封閉1 h，孵 育 一 抗Bax（1∶1 000）、Bcl?2（1∶1 000）、PARP（1∶1 000）、Cleaved?PARP（1∶500）、Caspase3（1∶1 000）、Cleaved?Caspase3（1∶500）、AKT（1∶1 000）、p?AKT（1∶1 000）、BCR（1∶1 000）、c?ABL（1∶1 000）、β?actin（1∶5 000）抗體，4℃孵育過夜，隨后回收一抗并以TBST洗滌膜3次，每次5 min，室溫搖床孵育對應的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）2 h，回收二抗，再次洗滌膜3次，每次5 min，最后加上適量的ECL超敏顯色液化學發(fā)光顯影。以β?actin為內(nèi)參，用ImageJ軟件分析目標蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值，相對表達量=目標灰度值/內(nèi)參灰度值。實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD?t檢驗。不同時點多組間比較采用重復測量設計的方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 木犀草素抑制K562細胞增殖CCK?8檢測結果顯示，隨木犀草素濃度增加及作用時間的延長，K562細胞增殖抑制率均呈增長趨勢（P＜0.05），見表1。

2.2 木犀草素誘導K562細胞凋亡流式細胞儀檢測結果顯示，木犀草素0、25、50μmol/L組K562細胞的凋亡率分別為8.21%±0.55%、23.43%±1.50%和40.47%±2.97%，細胞凋亡率依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=206.100，P＜0.05），見圖1。

2.3 木犀草素對凋亡相關蛋白表達的影響促凋亡蛋白Bax、Cleaved?PARP、Cleaved?Caspase3表達水平隨木犀草素濃度的增加而升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。木犀草素0、10、50 μmol/L組PARP蛋白表達水平依次升高（P＜0.05），100μmol/L組與50μmol/L組差異無統(tǒng)計學意義。木犀草素50μmol/L組Caspase3蛋白表達水平高于0、10μmol/L組，100μmol/L組明顯低于其余組（P＜0.05）。木犀草素50μmol/L組抗凋亡蛋白Bcl?2表達水平高于0μmol/L組（P＜0.05），與10μmol/L組差異無統(tǒng)計學意義；100μmol/L組明顯低于其余組（P＜0.05），見圖2、表2。

Tab.1 Comparison of the effect of luteolin on the proliferation between five K562 cell groups表1 木犀草素處理后各組細胞增殖抑制率比較（n=3，%，x±s）

Fig.1 The effect of luteolin on the apoptosis of K562 cells圖1 木犀草素對K562細胞凋亡的影響

Fig.2 The effect of luteolin on apoptosis?related proteins圖2 木犀草素對凋亡相關蛋白的影響

Tab.2 The expression levels of apoptosis-related proteins in four groups of K562 cells表2 各組K562細胞凋亡相關蛋白表達水平（n=3，x±s）

2.4 木犀草素對PI3K/AKT相關蛋白表達的影響木犀草素50、100μmol/L組p?AKT蛋白表達水平低于0、10μmol/L組，100μmol/L組低于50μmol/L組（F=55.170，P＜0.05），見圖3。

2.5 木犀草素對BCR?ABL融合蛋白表達的影響木犀草素50μmol/L組BCR?ABL融合蛋白表達水平高于0μmol/L組，100μmol/L組低于0、50μmol/L組（Fc?ABL抗體=1 556.000，F(xiàn)BCR抗體=3 802.000，P＜0.05），見圖4。

Fig.3 The effect of luteolin on the expressions of AKT and p?AKT protein in K562 cells圖3 木犀草素對K562細胞中AKT、p?AKT蛋白表達的影響

Fig.4 The effect of luteolin on the expressions of BCR,c?ABL and BCR?ABL protein in K562 cells圖4 木犀草素對K562細胞BCR、c?ABL以及BCR?ABL蛋白表達的影響

3 討論

CML是一種克隆性骨髓干細胞疾病，主要特征為染色體易位產(chǎn)生融合蛋白BCR?ABL，激活一系列細胞增殖相關信號，加速細胞分裂，從而導致疾病的發(fā)生［1］。伊馬替尼是目前治療CML的首選藥物，但其對部分CML患者的治療效果欠佳［1，9］，進一步尋找CML的治療藥物具有重要的臨床意義。

木犀草素是一種天然黃酮化合物，已有研究發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細胞的增殖具有一定的抑制作用［8,10?11］。本研究結果顯示，木犀草素可抑制K562細胞的增殖，且其抑制作用呈劑量及時間依賴性；流式細胞術結果顯示，木犀草素可誘導K562細胞的凋亡。王旭光等［12］研究亦顯示，木犀草素可抑制K562細胞的增殖，與本研究結果一致。

凋亡是細胞程序性死亡的一種主要形式。在接收到上游凋亡信號后，細胞染色質(zhì)固縮，細胞質(zhì)起皺，DNA片段化降解，細胞最終死亡［13］。Bcl?2家族是調(diào)控細胞凋亡的重要信號蛋白家族之一［14］，Bax蛋白是線粒體應激誘導凋亡的重要組分。在受到凋亡性刺激后，Bax轉位至線粒體膜，增加膜的通透性導致細胞色素C從線粒體釋放，釋放的細胞色素C進一步激活Caspase信號啟動凋亡［15?16］。Bcl?2為抑制凋亡蛋白，能抑制線粒體細胞色素C的釋放，從而抵抗凋亡性刺激導致的細胞凋亡［15?16］。本研究結果顯示，木犀草素處理細胞后促凋亡蛋白Bax表達水平升高，提示木犀草素可誘導細胞凋亡。Caspase3是凋亡的關鍵效應因子之一，其對多種關鍵蛋白有裂解作用，裂解的Caspase3可以剪切PARP并誘導凋亡［17?18］。Caspase3和PARP的裂解在細胞凋亡中具有重要作用［13］。本研究結果顯示，促凋亡蛋白Cleaved?Caspase3、Cleaved?PARP表達水平隨木犀草素濃度的增加而升高，提示木犀草素可能通過激活Caspase級聯(lián)進一步誘導了細胞的凋亡。與本研究結果類似，木犀草素在乳腺癌［7，11］、結直腸癌［8］等多種腫瘤中也可誘導細胞的凋亡，以上研究結果進一步證實木犀草素具有抗腫瘤作用。

PI3K/AKT信號通路是常見的信號通路之一，活化的AKT能抑制促凋亡蛋白的表達，保持細胞存活［19］。腫瘤中異常激活的PI3K/AKT信號在細胞的存活與增殖中發(fā)揮著重要作用［20?22］。Yao等［23］研究報道木犀草素可通過抑制PI3K/AKT信號抑制細胞增殖并誘導黑色素瘤細胞凋亡。本研究結果顯示，木犀草素50、100μmol/L組p?AKT蛋白表達水平低于0、10μmol/L組，100μmol/L組低于50μmol/L組，提示在較高濃度的木犀草素（50、100μmol/L）作用下，K562細胞的PI3K/AKT信號通路受到了抑制；但在較低濃度的木犀草素（10μmol/L）并未顯示出對該信號的抑制。結合流式細胞術細胞凋亡結果，筆者推測較高濃度（50μmol/L、100μmol/L）的木犀草素可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制K562細胞的增殖及誘導細胞凋亡，但在較低濃度的木犀草素作用中PI3K/AKT信號很可能尚處于應激反應的前期，可能有其他的信號參與了細胞對凋亡相關蛋白的調(diào)控。

考慮到CML存在特異性的BCR?ABL融合蛋白［24］，本研究分析了木犀草素對BCR?ABL融合蛋白的影響。結果顯示，50μmol/L的木犀草素作用K562細胞時BCR?ABL融合蛋白表達有所增加，而100μmol/L的木犀草素顯著抑制了BCR?ABL蛋白的表達。BCR?ABL融合蛋白可導致不受控制的細胞增殖［25］，結合流式細胞術細胞凋亡結果，筆者推測不同濃度的木犀草素可應激性地調(diào)控K562細胞增殖，最終抑制細胞增殖。PI3K/AKT信號也是能被受體偶聯(lián)的酪氨酸激酶所激活的下游信號之一［26?27］，結合BCR?ABL的表達結果，筆者認為高濃度（100 μmol/L）木犀草素可能通過某種途徑降低了BCR?ABL蛋白的表達，參與負調(diào)控PI3K/AKT信號，從而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡；但在較低濃度的木犀草素作用下，其抑制增殖、誘導凋亡的機制仍有待進一步研究探索。

綜上所述，木犀草素可抑制K562細胞的增殖，誘導凋亡相關蛋白表達并促進細胞的凋亡，其機制可能與調(diào)控BCR?ABL蛋白表達及PI3K/AKT信號通路有關。