李鵬林 秦世雯 張石來(lái) 黃光福 張靜 呂建平 胡鳳益*

（1 云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院/云南省多年生稻工程技術(shù)研究中心，昆明 650504；2 云南省植保植檢站，昆明 650034；第一作者：lipenglin@mail.ynu.edu.cn；*通訊作者：hfengyi@ynu.edu.cn）

多年生稻是指種植一次可以連續(xù)收獲多年（季）的水稻，即從第2年（季）起不再需要買(mǎi)種、育秧、犁田耙田、栽秧等生產(chǎn)環(huán)節(jié)，大大減少了勞動(dòng)力投入和減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度，是一項(xiàng)輕簡(jiǎn)化的稻作生產(chǎn)技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)包括了多年生稻品種及配套的耕作栽培技術(shù)[1-2]。近年來(lái)，云南大學(xué)已成功利用長(zhǎng)雄野生稻（Oryza longistaminata）地下莖無(wú)性繁殖特性培育出多年生稻品種[1-3]。其中，多年生稻23（PR23）已通過(guò)云南省審定（審定編號(hào)：滇審稻2018033號(hào)），云大24（PR24）、云大25（PR25）、云大101（PR101）、云大107（PR107）等品系也開(kāi)始試驗(yàn)試種。通過(guò)前期在云南省內(nèi)多年多點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，盡管多年生稻品種（系）的父本長(zhǎng)雄野生稻攜帶有水稻白葉枯病抗性基因Xa21[4-5]，但多年生稻品種（系）在各地的白葉枯抗性表現(xiàn)不一。多年生稻品種（系）是否具備白葉枯病抗性并攜帶相關(guān)抗病基因并不十分清楚，導(dǎo)致在多年生稻抗白葉枯病育種和生產(chǎn)應(yīng)用上指導(dǎo)性不強(qiáng)。

因此，本研究通過(guò)田間病情調(diào)查、人工接種抗性水平鑒定和抗性基因檢測(cè)3種方法，對(duì)多年生稻品種（系）PR23、PR24、PR25、PR101、PR107及其親本長(zhǎng)雄野生稻、RD23和F1（RD23/長(zhǎng)雄野生稻）進(jìn)行白葉枯病抗性鑒定，以明確多年生稻品種（系）的白葉枯病抗性水平，為今后多年生稻遺傳育種、生產(chǎn)防控，以及產(chǎn)業(yè)布局提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以PR23、PR24、PR25、PR101、PR107、長(zhǎng)雄野生稻（多年生稻的父本）、RD23（多年生稻的母本）、F1（RD23/長(zhǎng)雄野生稻）共計(jì)8個(gè)材料進(jìn)行白葉枯病抗性鑒定。其中，長(zhǎng)雄野生稻來(lái)源于非洲尼日爾，RD23是泰國(guó)優(yōu)質(zhì)秈稻，雜交后通過(guò)幼胚挽救技術(shù)獲得了F1植株，經(jīng)過(guò)多世代的自交，選育出PR23、PR24、PR25、PR101、PR107等多年生稻品種（系）。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)材料于2019年種植于西雙版納州多年生稻育種基地，海拔為580 m，年平均氣溫22.6 ℃，年降水量1 200 mm。西雙版納州氣候高溫高濕，水稻生產(chǎn)易感染白葉枯病。田間調(diào)查在西雙版納傣族自治州示范推廣田塊進(jìn)行。

1.3 田間管理

接種用品種（系）7月15日播種，8月5日移栽大田，每個(gè)品種栽4行，移栽行株距為20 cm×20 cm，單苗移栽，每行10株。示范田早稻播種期為1月15日，移栽期為3月1日，晚稻播種期和移栽期與接種用品種一致，移栽行株距為20 cm×20 cm，每叢栽1～2苗。接種田和示范田田間水肥管理參照當(dāng)?shù)卮竺娣e水稻生產(chǎn)田。

表1 水稻白葉枯病分級(jí)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.4 白葉枯病抗性鑒定

1.4.1 田間病情調(diào)查

6月、10月對(duì)西雙版納州試驗(yàn)田及示范推廣田塊的PR23、PR24、PR25、PR101、PR107，以及長(zhǎng)雄野生稻、RD23和F1（RD23/長(zhǎng)雄野生稻）進(jìn)行早稻和晚稻的田間白葉枯病病情調(diào)查，采用五點(diǎn)取樣調(diào)查法，病級(jí)評(píng)價(jià)參照已有標(biāo)準(zhǔn)[6]（表1）。

1.4.2 田間接種鑒定

選取9個(gè)不同致病力的水稻白葉枯病生理小種用于抗性水平鑒定，即YP1、YP2、YP3、YP4、YP5、YP6、YP7、YP8、YP9菌株（由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室分離鑒定并提供）。其中，YP1為弱致病力菌株，YP6為強(qiáng)致病力菌株。病原菌分別于PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖或蔗糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL）上30℃培養(yǎng)72 h后，配制3×108CFU/mL菌液備用。選取生長(zhǎng)時(shí)期一致的多年生稻葉片，于15∶00、溫度為28℃～30℃時(shí)，采用剪葉法接種[7]，即剪去葉尖1～3 cm進(jìn)行傷口接種。每個(gè)菌株接種4個(gè)植株，每個(gè)植株接種3～5個(gè)葉片（劍葉和上3葉）。接種21 d后調(diào)查白葉枯病發(fā)病情況。

1.4.3 抗性基因檢測(cè)

1.4.3.1 DNA制備 取0.1 g PR23、PR24、PR25、PR101、PR107、長(zhǎng)雄野生稻、RD23、F1（RD23/長(zhǎng)雄野生稻）的幼嫩葉片，CTAB法[8]提取其基因組DNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.2 PCR鑒定 基于已報(bào)道和克隆的10個(gè)抗白葉枯病基因，包括7個(gè)顯性抗病基因（Xa1、Xa3、Xa4、Xa10、Xa21、Xa23、Xa27）和3個(gè)隱性抗病基因（xa5、xa13、xa25）。利用已發(fā)表的功能標(biāo)記或分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表2），利用聚丙烯酰胺凝膠電泳[9]和1%～2%的瓊脂糖凝膠電泳[10]對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病情調(diào)查

從表3可見(jiàn)，長(zhǎng)雄野生稻、F1、PR101在早、晚稻全生育期對(duì)白葉枯病均表現(xiàn)出中抗以上抗性水平；RD23在早稻全生育期表現(xiàn)出中抗以上抗性水平，在晚稻的分蘗期和孕穗期表現(xiàn)出中感和感（表3）；5個(gè)多年生稻品種（系）均不同程度感白葉枯病，其中，PR107感病最嚴(yán)重，在早、晚稻苗期、分蘗期和孕穗期均表現(xiàn)出感病。

2.2 抗性水平評(píng)價(jià)

從供試菌種看，YP6菌株致病力最強(qiáng)，除了長(zhǎng)雄野生稻外，能使多年生稻品種（系）以及RD23和F1均感?。籝P1菌株致病力相對(duì)最弱，8個(gè)材料均對(duì)其表現(xiàn)出抗性（表4）。

表3 多年生稻白葉枯病田間病情調(diào)查結(jié)果

表4 多年生稻品種（系）及其親本和F1田間病情調(diào)查和抗性水平評(píng)價(jià)結(jié)果

表5 白葉枯病抗性基因在多年生稻品種（系）中的分子檢測(cè)結(jié)果

從多年生稻品種（系）看，長(zhǎng)雄野生稻對(duì)9個(gè)供試菌種均表現(xiàn)出抗?。籔R101對(duì)YP6菌株表現(xiàn)為中感，但對(duì)其他8個(gè)菌株均表現(xiàn)為中抗以上；PR23、PR24和PR25對(duì)9個(gè)菌株具有不同的抗性表現(xiàn)，對(duì)YP6、YP7、YP8、YP9菌株的感病程度與田間病情調(diào)查結(jié)果一致；PR107對(duì)除YP1外的8個(gè)菌株均表現(xiàn)出感?。ū?）。

不同致病力生理小種的抗性水平鑒定結(jié)果雖然與田間調(diào)查結(jié)果存在一定差異，但感抗病情況基本吻合，說(shuō)明該抗性水平評(píng)價(jià)結(jié)果可以直接指導(dǎo)田間白葉枯病害防治。

2.3 抗病基因檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR24、PR25、PR101和PR107具有Xa1、Xa4、Xa23和xa25等位基因，說(shuō)明這些材料具有潛在的Xa1、Xa4、Xa23、xa25抗性基因。田間病情調(diào)查結(jié)果（表4）表明，RD23、PR23、PR24和PR25、PR107均感白葉枯病，而長(zhǎng)雄野生稻、F1和PR101均抗白葉枯病，說(shuō)明RD23、PR23、PR24、PR25、PR107攜帶的為感病等位基因，長(zhǎng)雄野生稻、F1、PR101可能攜帶部分相關(guān)基因的抗病等位基因。

Xa3/Xa26基因的功能標(biāo)記檢測(cè)顯示，在長(zhǎng)雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107都未擴(kuò)增出基因條帶，推測(cè)長(zhǎng)雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107中可能不攜帶Xa3/Xa26基因。Xa21基因的功能標(biāo)記檢測(cè)顯示，只有長(zhǎng)雄野生稻中擴(kuò)增出抗病基因帶型，而在RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107擴(kuò)增出感病基因帶型，PR24中未擴(kuò)增出條帶，推測(cè)Xa21基因雖然是來(lái)源于長(zhǎng)雄野生稻的白葉枯病抗性基因，但是沒(méi)有遺傳到其衍生的多年生稻品種（系）中。白葉枯病抗性基因xa25在RD23、PR23、PR24、PR25和PR107中為感病基因型（860 bp），且RD23、PR23、PR24、PR25和PR107均感白葉枯病，而在F1和PR101中為抗病基因型（約930 bp），推測(cè)xa25可能在F1和PR101的抗白葉枯病中起到了積極作用。Xa27基因功能標(biāo)記檢測(cè)表明，在長(zhǎng)雄野生稻、F1和PR101中擴(kuò)增出了抗病基因帶型，PR107中未擴(kuò)增出條帶，在RD23、PR23、PR24、PR25擴(kuò)增出感病基因帶型，這與長(zhǎng)雄野生稻、F1、PR101在田間病情調(diào)查結(jié)果相符，說(shuō)明PR101可能攜帶Xa27抗病基因，起到主要抗病作用。

PR23、PR24、PR25和PR107攜帶已知的白葉枯病抗性基因Xa1、Xa4、Xa23、xa25的等位基因，但均感病，說(shuō)明這幾個(gè)抗病等位基因在這些材料中為感病基因型；雖然長(zhǎng)雄野生稻攜帶已知白葉枯病抗性基因Xa1、Xa4、xa25、Xa21、Xa23、Xa27，但從其F1及衍生的5個(gè)多年生稻品種（系）的田間病情調(diào)查結(jié)果和攜帶基因看，Xa27和xa25基因可能是由長(zhǎng)雄野生稻遺傳給PR101并賦予其白葉枯病抗性的主要原因。

因此，PR101抗白葉枯病是由于其可能攜帶來(lái)自長(zhǎng)雄野生稻的Xa27、xa25基因，而PR23、PR24、PR25和PR107這4個(gè)多年生稻品種（系）不具備本研究中用到的10個(gè)抗白葉枯病基因。

3 結(jié)論和討論

白葉枯病在秈稻和粳稻中發(fā)病情況具有一定差異，一般秈稻重于粳稻，晚稻重于早稻[20]。根據(jù)對(duì)不同致病力白葉枯病菌生理小種抗性水平鑒定發(fā)現(xiàn)，PR101對(duì)大部分白葉枯病生理小種表現(xiàn)出抗性，并與田間生產(chǎn)條件下表現(xiàn)一致；PR23、PR24和PR25僅對(duì)部分白葉枯病生理小種具有抗性，需要進(jìn)一步進(jìn)行白葉枯病抗性遺傳改良；PR107對(duì)大部分白葉枯病生理小種均感病，是制約其推廣應(yīng)用的主要限制因素，急需進(jìn)行白葉枯病的抗性改良。

多年生稻PR23、PR24、PR25、PR101和PR107中均不含xa5、Xa3/Xa26、xa13、Xa10、Xa21抗病等位基因。PR23、PR24、PR25和PR107攜帶白葉枯病抗性等位基因Xa1、Xa4、Xa23、xa25，但根據(jù)田間病情調(diào)查發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)品系均感病，說(shuō)明Xa1、Xa4、Xa23、xa25抗性等位基因在PR23、PR24、PR25、PR107中不起抗病作用；在長(zhǎng)雄野生稻中檢測(cè)到攜帶有Xa1、Xa4、Xa21、Xa23、xa25和Xa27等白葉枯病抗性等位基因，但從其F1及衍生的5個(gè)多年生稻品種（系）的田間病情調(diào)查結(jié)果和攜帶基因看，xa25、Xa27基因可能是通過(guò)長(zhǎng)雄野生稻遺傳到PR101的白葉枯病抗性等位基因。

xa25是一個(gè)隱性的抗白葉枯病主效基因，與其對(duì)應(yīng)的顯性基因是Xa25。xa25的供體品種是明恢63，對(duì)白葉枯菌生理小種PXO339表現(xiàn)為?；钥剐訹21]。由于xa25的啟動(dòng)子突變，導(dǎo)致PthXo2無(wú)法被識(shí)別，則其表達(dá)便不受誘導(dǎo)，表現(xiàn)為抗性[22-23]。xa25的表達(dá)受顯性等位基因Xa25的調(diào)控。王石平等[24]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將xa25的部分DNA片段導(dǎo)入到水稻品種中，抑制其表達(dá)從而增強(qiáng)水稻品種的抗性。所以猜想PR101可能是由于抑制了xa25的表達(dá)而表現(xiàn)為抗白葉枯病。

已有報(bào)道，白葉枯病抗性等位基因Xa27來(lái)自小粒野生稻（O.minuta）[7,25]，而來(lái)源于長(zhǎng)雄野生稻的Xa27等位基因也可能是白葉枯病的抗性等位基因。WU等[26]發(fā)現(xiàn)，Xa27的表達(dá)是通過(guò)增加葉片維管束次生細(xì)胞壁厚度來(lái)抵御病原菌的侵染，推測(cè)PR101能抵抗白葉枯病可能是通過(guò)增加維管束次生細(xì)胞壁的厚度來(lái)抵御侵害。

多年生稻PR101對(duì)白葉枯病表現(xiàn)出良好抗性，可作為改良水稻抗白葉枯病的基因庫(kù)。深入研究多年生稻PR101對(duì)白葉枯病的抗性反應(yīng)，有助于水稻白葉枯病抗病育種研究，拓寬水稻抗白葉枯病育種的材料基礎(chǔ)；而在利用PR23、PR24、PR25和PR107進(jìn)行稻作生產(chǎn)時(shí)，需要注意及時(shí)有效的進(jìn)行白葉枯病防治。