余 琴 陳昌誼 龔 瑤

1.重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院(401329)；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

宮頸癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二，而死亡率居首位[1]。手術(shù)、化學療法和放射療法是目前常用治療方法。微小RNA(miRNA)是短調(diào)控RNA，通過與目標基因轉(zhuǎn)錄本的互補位點結(jié)合翻譯抑制控制基因表達[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p在多種腫瘤發(fā)生中起抑制作用，在肝癌細胞株(HepG2、SMMC-7721、Bel-7402等)中表達下調(diào)，miR-331-3p通過下調(diào)E2F1促進肝癌細胞增殖和遷移，且隨著肝癌細胞株侵襲轉(zhuǎn)移程度增加表達下調(diào)[3]。本研究通過探討miR-331-3p靶向神經(jīng)纖毛蛋白-2(NRP2)對宮頸癌細胞增殖、遷移以及侵襲的影響，為臨床靶向治療宮頸癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要實驗試劑人正常宮頸上皮細胞HcerEpic、人宮頸癌HeLa細胞系(美國ATCC細胞庫)，10%胎牛血清(美國Clark Bioscience公司)，胰蛋白酶(含EDTA)(美國Gibco公司)，miR-331-3p、NRP2質(zhì)粒和各引物序列(廣州市銳博生物科技有限公司)，50 U/ml青霉素-鏈霉素、RIPA裂解液、Trizol試劑和BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)，兔來源單克隆一抗NRP2、PCNA、MMP-2、MMP-9、GAPDH和山羊抗兔單克隆二抗(美國Abcam公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenPCR Master Mix 試劑盒(TaKaRa公司)，Transwell小室、F12培養(yǎng)基(美國BD公司)，ECL發(fā)光液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)。

1.1.2主要儀器實時熒光定量PCR儀、ECL發(fā)光儀(Bio-Rad公司)，低溫高速離心機(Thermo公司)，倒置光學顯微鏡和成像系統(tǒng)(Nikon)，酶標儀(Servicebio)，ABI 7900序列檢測系統(tǒng)上的Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)。

1.2 建立細胞模型及分組

人宮頸癌HeLa細胞加入含有50 U/ml青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)轉(zhuǎn)染不同將HeLa細胞分為對照組、mimic NC組、miR-331-3p mimic組、siRNA NC組、si-NRP2組、miR-331-3p mimic+NRP2組。將100 μl質(zhì)粒終濃度為100 nmol/L的Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)染至各組，其中mimic組和miR-331-3p mimic組分別轉(zhuǎn)染mimic NC和miR-331-3p mimic質(zhì)粒；siRNA NC 組和si-NRP2組分別轉(zhuǎn)染siRNA NC和si-NRP2；miR-331-3p mimic+NRP2組轉(zhuǎn)染miR-331-3p mimic和NRP2過表達質(zhì)粒；對照組不轉(zhuǎn)染。

1.3 觀察指標

1.3.1miR-331-3p靶基因利用TargetScan數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-331-3p潛在靶基因。將擴增的NRP2-3'-UTR-WT和相應(yīng)的NRP2-3'-UTR-Mut分別插入pGL3熒光素酶載體(Promega)中。通過Lipofectamine 2000將NRP2的野生型或突變型3'-UTR與miR-331-3p模擬物或模擬物對照共轉(zhuǎn)染至HeLa細胞，使用雙重螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后48 h的相對螢光素酶活性。

1.3.2miR-331-3p和NRP2mRNA表達使用TRIzol試劑從HcerEpic和各組HeLa細胞中分離總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄溫度條件：37℃持續(xù)15 min，85℃持續(xù)5 s。qRT-PCR測定，通過SYBR進行分析。以U6或GAPDH為內(nèi)參。所用引物：miR-331-3p：Forward：5'-GAGCTGAAAGCACTCCCAA-3'和Reverse：5'-CACACTCTTGATGTTCCAGGA-3'；U6：Forward：5′-AGAGCCTG TGGTGTCCG-3′和Reverse：5′-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3′；NRP2：Forward：5'-CCCCGAACCCAACCAGAAGA-3'和Reverse：5'-GAATGCCATCCCAGATGTCCA-3'；GAPDH：Forward：5'-GGCACTGAGA AGCGGGGCCG-3'和Reverse：5'-CCCTTGTTTTTTGCTTCCC TT-3'。qRT-PCR條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，共35個循環(huán)，使用2-△△Cq確定基因相對表達。

1.3.3NRP2、MMP-2、MMP-9、PCNA蛋白表達將轉(zhuǎn)染的細胞在含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中冰上溶解，使用BCA試劑盒測量總蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)裂解物用10%SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST配置的5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。將膜與一抗[NRP2(1：4000)、GAPDH(1：1000)、MMP-2(1：2000)、MMP-9(1：2000)和PCNA(1：2000)]在4℃過夜。室溫下將該膜與抗兔IgG(1：5000)孵育2 h?；瘜W發(fā)光檢測系統(tǒng)(Beyotime)檢測蛋白條帶。

1.3.4細胞增殖使用CCK-8試劑盒確定細胞活力。轉(zhuǎn)染后，將100 μl細胞(每孔5×103個細胞)接種到96孔板中。在0、24、48和72 h，將10 μl CCK-8溶液添加到每個孔中。孵育1 h后酶標儀測定450 nm處吸光度。

1.3.5細胞遷移將HeLa(5×105個/孔)細胞鋪在6孔板中12 h，以80%～90%匯合，使用無菌移液器吸頭刮擦0.5 mm。每個孔用PBS洗滌兩次。使用倒置顯微鏡在0、24 h拍攝細胞遷移到劃痕的過程。用Image-Pro Plus軟件6.0分析結(jié)果。

1.3.6Transwell實驗檢測細胞侵襲將轉(zhuǎn)染的細胞用胰蛋白酶消化，洗滌并以每孔1×105個細胞的接種密度接種在標準的24孔室(上室)中，并將FBS作為吸引劑加入到培養(yǎng)板(下室)中，孵育24 h后將下室固定并用結(jié)晶紫染色，48 h后使用顯微鏡計侵襲細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 miR-331-3p在宮頸癌HeLa細胞中表達

與人正常宮頸上皮細胞(1.00±0.04、1.00±0.05)相比，宮頸癌HeLa細胞中miR-331-3p(0.43±0.03)下降(P<0.05)，而NRP2 mRNA(2.34±0.08)升高(P<0.05)。

2.2 miR-331-3p對NRP2基因的靶向調(diào)控作用

與對照組(1.00±0.05)和mimic NC組(0.98±0.07)相比，miR-331-3p mimic組miR-331-3p(4.64±0.08)升高(P<0.05)；與對照組(1.00±0.05)、mimic NC組(0.99±0.06)或siRNA NC組(0.98±0.04)相比，miR-331-3p mimic組(0.54±0.05)和si-NRP2組NRP2 mRNA(0.26±0.05)均降低(均P<0.05)；與對照組(1.01±0.06)、mimic NC組(1.04±0.06)或siRNA NC組(1.01±0.06)相比，miR-331-3p mimic組(0.76±0.06)和Si-NRP2組NRP2(0.37±0.03)均降低(均P<0.05)。見圖1(2486頁)。行雙重熒光素酶報告基因檢測，與mimic NC組(1.00±0.09)相比，miR-331-3p mimic組NRP2 3'-UTR-WT的報告基因的相對熒光素酶活性(0.35±0.05)降低(P<0.05)，但miR-331-3p組NRP2 3'-UTR-MUT的螢光素酶活性(1.04±0.06)與mimic NC組(1.03±0.07)相比沒有變化(P>0.05)。

2.3 miR-331-3p過表達或抑制NRP2表達對HeLa細胞增殖能力影響

細胞培養(yǎng)72 h后，與對照組(0.50±0.06)和mimic NC組(0.49±0.05)相比，過表達miR-331-3p的HeLa細胞OD值(0.34±0.04)減少，增殖能力降低(P<0.05)；與對照組(0.52±0.06)和siRNA NC組(0.51±0.05)相比，抑制NRP2表達的HeLa細胞OD值(0.29±0.06)減少，增殖能力降低(P<0.05)。

2.4 miR-331-3p過表達或抑制NRP2表達對HeLa細胞遷移、侵襲能力的影響

與對照組(0.31±0.05、162±35)和mimic NC組(0.35±0.04、188±21)相比，過表達miR-331-3p后HeLa細胞劃痕寬度比(0.88±0.07)增加，細胞侵襲細胞數(shù)目(67±13)減少(均P<0.05)。見圖2A(2486頁)。與對照組(0.30±0.04、163±23)和siRNA NC組(0.34±0.05、161±28)比較，抑制NRP2的表達HeLa劃痕寬度比(0.74±0.10)增加，細胞侵襲細胞數(shù)目(26±5)減少(均P<0.05)。見圖2B(2486頁)。

2.5 miR-331-3p過表達或抑制NRP2表達對PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，過表達miR-331-3p或抑制NRP2的表達均可抑制PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(均P<0.05)。與對照組(0.70±0.06、0.73±0.06、0.44±0.05)和mimic NC組(0.71±0.06、0.72±0.06、0.45±0.05)相比，miR-331-3p mimic組PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達量(0.07±0.01、0.10±0.02、0.15±0.02)下降(P<0.05)。見圖3A(2486頁)；與對照組(1.22±0.07、0.70±0.06、0.81±0.06)和siRNA NC組(1.25±0.07、0.72±0.05、0.79±0.06)相比，si-NRP2組PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達量(0.18±0.02、0.06±0.02、0.39±0.03)下降(P<0.05)。見圖3B(2486頁)。

2.6 過表達NRP2逆轉(zhuǎn)miR-331-3p的作用

與miR-331-3p mimic組(0.32±0.03、0.82±0.04、69±8)相比，過表達NRP2后，HeLa細胞OD值(0.65±0.07)增加，細胞劃痕寬度比(0.15±0.03)減少、侵襲細胞數(shù)目(203±19)增加，細胞增殖、遷移和侵襲能力均提高(均P<0.05)。見圖4(2486頁)。

3 討論

宮頸癌發(fā)病機制復雜目前尚未明確定論。大量證據(jù)表明，miRNA在人類宮頸癌發(fā)展中起著重要作用[4]；在調(diào)節(jié)基因表達以及其他相關(guān)過程(例如侵襲和轉(zhuǎn)移)中起至關(guān)重要作用[5]。而分子層面細胞癌變的基礎(chǔ)是致癌因子的激活與抑癌基因的缺失，因此，研究宮頸癌相關(guān)的基因異常表達成為臨床研究熱點。

miR-331-3p已被鑒定為與腫瘤相關(guān)的miRNA，并作為獨立預后因素。Epis等[6]發(fā)現(xiàn)miR-331-3p和Aurora激酶抑制劑II聯(lián)合治療可抑制前列腺癌的發(fā)生和進展。Chen等[7]報道，在肝細胞癌患者中，血清miR-331-3p和miR-182可作為治療性生物標志物。Zhang等[8]證實miRNA-331-3p通過靶向elF4B基因抑制鼻咽癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，進而阻斷PI3K-AKT信號通路。miR-331-3p已被證實可調(diào)控細胞的增殖、轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲，然而在宮頸癌細胞中的作用尚不清楚。鑒于miRNA被廣泛稱為腫瘤調(diào)節(jié)劑，本研究為證明miR-331-3p在宮頸癌中起重要作用，通過qRT-PCR將miR-331-3p鑒定為宮頸癌中下調(diào)miRNA。此外，miR-331-3p的過表達能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，抑制宮頸癌細胞PCNA、MMP-2、MMP-9的蛋白表達[9-10]。

有研究miR-331-3p 通過抑制不同靶基因來抑制多種人類癌癥[11]。在人腎癌細胞中，miR-331-3p通過靶向HER2和NRP2抑制細胞增殖[12]。為更深一步確認miR-331-3p在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中調(diào)控作用，本研究通過Targetscan數(shù)據(jù)庫預測miR-331-3p的直接靶基因，結(jié)果表明miR-331-3p能夠與NRP2 3'-UTR直接靶向結(jié)合，表明NRP2可能是miR-331-3p的直接靶基因。進一步采用雙熒光素酶報告基因檢測和Western blot，結(jié)果驗證了NRP2是miR-331-3p的直接作用靶基因。

NRP2是人類端粒相關(guān)聚合酶家族成員之一，近期有研究表明，在肺癌，結(jié)腸直腸癌、胰腺癌以及神經(jīng)母細胞瘤中NRP2表達上調(diào)。Borkowetz等[13]研究表明NRP2是前列腺腺泡腺癌一個獨立預后因素，可縮短癌癥患者的生存期。Li等[14]研究證明NRP2促進甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷移和侵襲，并通過調(diào)節(jié)AKT和ERK磷酸化信號通路促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。Moriarty等[15]發(fā)現(xiàn)NRP2促進了黑色素瘤的進展和生長。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制NRP2的表達均可抑制細胞生長速度，減少侵襲細胞數(shù)目，增加劃痕寬度比；過表達miR-331-3p后NRP2表達下調(diào)，HeLa細胞增殖、遷移和侵襲能力受到阻礙，且抑制NRP2的表達可抑制宮頸癌細胞PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達。因此，提示miR-331-3p通過靶向NRP2基因抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。在過表達miR-331-3p的基礎(chǔ)上過表達NRP2能夠逆轉(zhuǎn)miR-331-3p對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-331-3p通過靶向NRP2抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖、遷移和侵襲。進一步將研究miR-331-3p抑制宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用機制，為臨床尋找宮頸癌治療靶點提供新方向。