李金玲, 李文茹, 謝小保, 張建設(shè)

1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070;2.浙江海洋大學(xué)，國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022

細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，耐藥菌造成的復(fù)雜性感染的治療已成為全球衛(wèi)生從業(yè)者關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題，引發(fā)人們擔(dān)憂是目前日益增加的多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥細(xì)菌造成的治療困境與緩慢的、甚至是滯后的開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物能力之間所形成的巨大差異[1]。按此趨勢(shì)發(fā)展下去，人類將會(huì)面臨無(wú)有效抗菌藥物可用的處境。

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于周圍環(huán)境中。是引起慢性感染和醫(yī)院內(nèi)感染的常見(jiàn)病原菌之一[2-3]。根據(jù)中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的報(bào)告發(fā)現(xiàn)，2005年—2018年P(guān)A的臨床分離率均位于前列，一直是治療院內(nèi)感染十分棘手的問(wèn)題[4-8]。一直以來(lái)，耐藥問(wèn)題是根除治療PA的最大障礙。而近些年有研究人員發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥是一種特殊的耐藥形式，是細(xì)菌耐藥進(jìn)化的中間過(guò)程。目前許多臨床工作者對(duì)異質(zhì)性耐藥的認(rèn)識(shí)較局限，并且異質(zhì)性耐藥在臨床上常規(guī)藥敏試驗(yàn)中多檢測(cè)為假敏感，誤導(dǎo)醫(yī)生治療用藥，是導(dǎo)致臨床感染治療失敗的重要原因。這就對(duì)治療PA引起的感染提出了新的挑戰(zhàn)。本文就PA的耐藥機(jī)制以及異質(zhì)性耐藥研究做一綜述。

1 銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

PA的耐藥機(jī)制復(fù)雜，主要可分為固有耐藥，獲得性耐藥以及適應(yīng)性耐藥。固有耐藥是指細(xì)菌通過(guò)自身固有的結(jié)構(gòu)或功能而產(chǎn)生的固有耐藥機(jī)制，通常由細(xì)菌本身的染色體基因編碼表達(dá)，并且具有遺傳性，菌株特性不會(huì)改變且可預(yù)測(cè)[9]。獲得性耐藥是細(xì)菌在對(duì)抗不利環(huán)境中逐漸進(jìn)化出的一系列調(diào)控體系，這些體系能隨環(huán)境的變化而做出反應(yīng)，從而提高細(xì)菌的耐藥性的一種現(xiàn)象[10-12]。適應(yīng)性耐藥是當(dāng)受到外界環(huán)境變化刺激時(shí)，細(xì)菌群體為降低其敏感性而啟動(dòng)的自調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)生短暫變化可產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥，當(dāng)刺激解除時(shí)，耐藥性是可逆的[13]，且不具備遺傳性。PA具有高水平的耐藥性，其主要耐藥機(jī)制為外膜通透性下降，激活外排泵系統(tǒng)，產(chǎn)生抗菌藥物失活酶等[14]。

1.1 外膜通透性下降

一般細(xì)菌的細(xì)胞外膜上含有允許小分子蛋白通過(guò)的孔蛋白，其中允許抗生素通過(guò)的孔蛋白包括OprC、OprD、OprE、OprF、OprG和OprH等[15]。有研究發(fā)現(xiàn)PA的外膜孔蛋白OprD2能夠允許碳青霉烯類抗生素通過(guò)，是目前所知的PA唯一的對(duì)抗生素有通透性的孔蛋白。OprD2編碼基因發(fā)生變化時(shí)，可能發(fā)生多點(diǎn)突變、缺失突變以及插入突變從而導(dǎo)致OprD2蛋白發(fā)生突變或缺失，進(jìn)而導(dǎo)致抗生素不能通過(guò)細(xì)胞外膜，大大降低了PA對(duì)碳青霉烯類抗生素的藥物敏感性[16]。徐偉紅等人也證明了OprD2的缺失可導(dǎo)致PA對(duì)亞胺培南、頭孢他啶、頭孢吡肟產(chǎn)生耐藥[17]。oprD基因編碼OprD2蛋白，oprD基因序列若是發(fā)生變動(dòng)則可能導(dǎo)致OprD2孔蛋白表達(dá)減少或缺失，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌外膜通透性發(fā)生變化，從而致使碳青霉烯類抗生素?zé)o法進(jìn)入細(xì)菌，具體在臨床上的表現(xiàn)則是細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素高度耐藥[18]。OprF作為PA最主要的孔蛋白，對(duì)大部分的抗生素的滲透效率較低，且大部分都是雙域封閉構(gòu)象，只有低于5%的部分是單域開(kāi)放構(gòu)象，因此PA的外膜通透性遠(yuǎn)低于其它細(xì)菌。此外有研究發(fā)現(xiàn)OprF的缺失可通過(guò)上調(diào)c-di-GMP水平的變化導(dǎo)致生物膜形成增加，從而增加細(xì)菌耐藥性[19]。OprD孔蛋白上含有碳青霉烯類抗生素的藥物結(jié)合位點(diǎn)，OprD的缺失將增加PA對(duì)這類抗菌藥物的耐藥性。此外，OprH是PA孔蛋白中最小的一種，缺失Mg2+將導(dǎo)致OprH的過(guò)度表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)LPS修飾穩(wěn)定細(xì)胞外膜，從而導(dǎo)致PA對(duì)多粘菌素B以及慶大霉素產(chǎn)生耐藥性[20]。

1.2 激活外排泵系統(tǒng)

外膜通透性的下降有時(shí)也難以完全闡釋PA的多重耐藥性，很多研究表明PA細(xì)胞膜上的藥物外排系統(tǒng)，與外膜蛋白的缺失或突變起協(xié)同作用，二者共同導(dǎo)致PA的多重耐藥[21]。目前依據(jù)氨基酸序列的同源性，將與抗菌藥物相關(guān)的膜外排分子分為五個(gè)超家族：ATP結(jié)合盒家族(ATP-Binding Cassette,ABC)、主要易化超家族(Major Facilitator Super family,MFS)、多藥和毒性化合物外排家族(Multidrug And Toxic microbial Extrusion,MATE)、小多藥耐藥家族(Small Multidrug Resistance,SMR)和耐藥結(jié)節(jié)分化家族(Resistance Nodulation and cell Division,RND)[22]。其中RND型外排系統(tǒng)在PA耐藥中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)報(bào)道已經(jīng)有12種RND外排系統(tǒng)，其中已通過(guò)基因檢測(cè)的有7種：MexABOprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN，MexXY-OprM，MexJK-OprM，MexGHI-OpmD和MexVW-OprM。其中能夠增加喹諾酮類抗生素外排的有MexAB-OprM和MexEF-OprN，增加β-內(nèi)酰胺類抗生素外排的是MexAB-OprM以及MexCD-OprJ，而MexXY-Oprm則主要與氨基糖苷類抗生素耐藥有關(guān)[23,24]。部分PA存在多種外排泵的過(guò)表達(dá)，使細(xì)菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致其耐藥性增強(qiáng)，且與多重耐藥PA(Multi-Drug Resistance,MDR-PA)的產(chǎn)生有關(guān)[25]。目前抗PA感染的治療方案是通過(guò)使用外排泵抑制劑(Efflux Pump Inhibitors,EPIs)。PAβN(Phenylalanine arginyl β-naphthylamide)作為一種外排泵抑制劑，主要原理是通過(guò)抑制細(xì)菌的外排泵而抑制抗生素的外排，且可增加細(xì)菌外膜的滲透性。已有研究證明PAβN能夠降低PA的毒力，減少群體感應(yīng)，且提高抗生素的敏感性[26,27]。國(guó)外有實(shí)驗(yàn)室對(duì)100株臨床分離的PA進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥株中有66株表現(xiàn)出mexB以及mexY外排基因的過(guò)表達(dá)[15,28]。有研究者對(duì)PA耐藥株進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥株存在多種外排泵的過(guò)表達(dá)，其中最多表達(dá)的外排泵為MexXY[29]。MexXY外排泵可通過(guò)外排胞內(nèi)抗菌藥物從而導(dǎo)致PA耐藥，有研究證明核糖體靶位藥物能夠誘導(dǎo)MexXY外排泵的高表達(dá)，導(dǎo)致外排氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物[30]。

1.3 產(chǎn)生抗菌藥物失活酶

氨基糖苷類抗生素是臨床治療PA感染的重要藥物，其作用機(jī)制為特異性結(jié)合16SrRNA的氨?；稽c(diǎn)并干擾蛋白質(zhì)合成[31]。2003年，來(lái)自日本的學(xué)者在抗氨基糖苷類PA臨床分離株中發(fā)現(xiàn)16SrRNA甲基化酶。含有這種酶的菌株能夠?qū)Π☉c大霉素、妥布霉素等氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生高度耐藥性。隨后有其他國(guó)家的研究者又發(fā)現(xiàn)了其他16SrRNA甲基化酶，其中在來(lái)自巴西的PA中發(fā)現(xiàn)RmtD，可產(chǎn)生金屬 β-內(nèi)酰胺酶SPM-1，因此該菌株對(duì)碳青霉烯類及氨基糖苷類抗生素具有高度抗藥性[32-34]。

β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌產(chǎn)生的可水解 β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素的酶，該酶的產(chǎn)生可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì) β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，PA可產(chǎn)生包括PSE-1(CARB-2)，PSE-4(CARB-1)，CARB-3和CARB-4在內(nèi)的多種β-內(nèi)酰胺酶[35]。AmpC酶是由PA和腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生的一種 β-內(nèi)酰胺酶，而研究表明克拉維酸在一定濃度下可誘導(dǎo)PA中AmpC酶的表達(dá)，因此在臨床治療PA的過(guò)程中應(yīng)避免克拉維酸的使用[36]。

對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的PA的病毒抑制因子的產(chǎn)生進(jìn)行分析，結(jié)果表明毒素的分泌與β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生有很強(qiáng)的相關(guān)性，攜帶ESBLs的細(xì)菌比不攜帶ESBLs的細(xì)菌致病性及耐藥性更強(qiáng)。因此，PA的耐藥性可能與抗菌活性酶、色素表達(dá)及毒力基因的表達(dá)有關(guān)[37]。國(guó)外某研究室對(duì)臨床分離的102株P(guān)A進(jìn)行檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)兩種與抗菌活性酶相關(guān)的耐藥基因：CTX-M-15和OXA-10[38]。

1.4 基因突變

突變可以導(dǎo)致抗菌藥物攝取減少、抗菌藥物靶點(diǎn)發(fā)生改變、外排泵和抗菌藥物失活酶過(guò)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致抗菌藥物失效[10]。有研究表明，DNA氧化修復(fù)系統(tǒng)的失活能夠增加PA的突變頻率，進(jìn)而導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生增加及MexCD-OprJ 外排泵功能過(guò)表達(dá)。自發(fā)突變亦會(huì)影響細(xì)菌特定孔蛋白的表達(dá)或功能，從而降低外膜通透性，增加細(xì)菌的耐藥性。例如，PA中OprD的缺失使其對(duì)碳青霉烯類抗生素具有很高的耐藥性[39]。如前所述，外排泵過(guò)表達(dá)可降低PA對(duì)抗生素的敏感性[11]。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MexR、NalB、NalC或NalD編碼基因的突變可導(dǎo)致外排泵MexAB-OprM過(guò)表達(dá)，使PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類抗生素的敏感性大大降低[40,41]。nfxB基因突變可引起外排泵MexCD-OprJ過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致PA對(duì)氟喹諾酮類及青霉烯類抗生素的敏感性減低。

干擾抗菌藥物作用靶點(diǎn)是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的常見(jiàn)機(jī)制。因此，PA藥物靶點(diǎn)的突變可通過(guò)干擾抗菌藥物作用靶點(diǎn)而產(chǎn)生耐藥性。有研究發(fā)現(xiàn)編碼DNA回旋酶的基因gyrA和gyrB或編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的基因parC和parE的突變可導(dǎo)致PA與喹諾酮類抗生素的結(jié)合親和力降低，使PA對(duì)其敏感性下降[42]。結(jié)合本課題組的研究發(fā)現(xiàn)魏氏檸檬酸桿菌中的csgA基因缺失可能導(dǎo)致抗菌藥物的作用位點(diǎn)缺失，從而導(dǎo)致耐藥性的提高[43]。

基因突變導(dǎo)致抗菌藥物失活酶的過(guò)表達(dá)是PA的產(chǎn)生耐藥的常見(jiàn)機(jī)制[10]。編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因ampC突變導(dǎo)致的β-內(nèi)酰胺酶合成增加，使PA對(duì)頭孢菌素抗生素敏感性減低[44]。

1.5 獲得耐藥基因

耐藥基因可由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和噬菌體攜帶，細(xì)菌通過(guò)從相同或不同菌種的水平基因轉(zhuǎn)移獲得這些基因，這在PA抗菌藥物耐藥性的傳播中起著關(guān)鍵作用[45]。目前已知的水平基因轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等。PA存在獲得性耐藥基因，可對(duì)氨基糖苷類以及β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性。例如，有基因元件質(zhì)粒和整合子攜帶的金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-Beta-Lactamases,MBLs)基因，可產(chǎn)生包括IMP、VIM、SPM、GIM、NDM和FIM在內(nèi)的多種B類β-內(nèi)酰胺酶而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[46]。此外，一個(gè)整合子可以攜帶多個(gè)抗菌藥物的耐藥基因。

1.6 生物膜的形成

細(xì)菌生物膜是指由細(xì)菌以及自身分泌的胞外基質(zhì)組成的黏附于物體表面相互聚集而形成的聚合物。胞外基質(zhì)包括胞外多糖、脂類、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和胞外DNA(eDNA)等，可介導(dǎo)細(xì)菌之間進(jìn)行黏附，并組成生物膜的基本結(jié)構(gòu)。當(dāng)PA形成生物膜后，分泌的胞外多糖形成一種滲透屏障，阻礙抗菌藥物擴(kuò)散至菌體內(nèi)，從而增強(qiáng)其耐藥性[47]。

張艷芳等人研究發(fā)現(xiàn)對(duì)亞胺培南耐藥型PA的生物膜形成能力較亞胺培南敏感型PA更強(qiáng)[48]，說(shuō)明生物膜的形成在PA對(duì)抗碳青霉烯類抗生素中具有一定作用。GONCALVES等人對(duì)5株MBL陽(yáng)性PA的生物膜形成能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明所有菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物膜形成能力，進(jìn)一步表明生物膜的形成在PA對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥中發(fā)揮重要作用[49]。

1.7 滯留菌的形成

滯留菌約占生物膜細(xì)胞的1%，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，代謝不活躍，對(duì)抗菌藥物高度耐受。大多數(shù)PA能夠被抗菌藥物殺死，但是由于滯留菌處于休眠狀態(tài)，導(dǎo)致停止了對(duì)于抗菌藥物作用靶點(diǎn)的合成，因此，滯留菌能夠保持活性[50]。滯留菌在有抗菌藥物的環(huán)境中，不會(huì)增殖，但是，一旦離開(kāi)抗菌藥物的作用，就會(huì)恢復(fù)生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致感染遷延不愈。溫度、ph等環(huán)境刺激以及群體感應(yīng)等都對(duì)滯留菌的形成和增殖有所影響[51-52]。

2 銅綠假單胞菌異質(zhì)性耐藥有關(guān)研究

近年來(lái)，臨床工作者在篩查耐藥菌株過(guò)程中發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，在包括PA在內(nèi)的多種革蘭氏陰性菌中報(bào)道的越來(lái)越多。因此，異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象引起了廣泛的關(guān)注和重視。

2.1 異質(zhì)性耐藥的定義

異質(zhì)性耐藥是指在體外的藥敏實(shí)驗(yàn)中，大部分細(xì)菌亞群對(duì)抗生素敏感，而有一小部分亞群產(chǎn)生耐藥，甚至有極少數(shù)的亞群出現(xiàn)高水平耐藥的現(xiàn)象。異質(zhì)性耐藥是細(xì)菌中的同源亞群對(duì)某種抗生素表現(xiàn)出不同的敏感性，被認(rèn)為是細(xì)菌由敏感進(jìn)化成完全耐藥的中間階段[53-54]。目前，對(duì)于異質(zhì)性耐藥的定義有了新的說(shuō)明，NICOLOFF等研究者更新了EL-HALFAWY等人對(duì)異質(zhì)性耐藥菌株的定義，EL-HALFAWY等人主要側(cè)重于異質(zhì)性耐藥菌株中耐藥細(xì)胞亞群的存在，認(rèn)為其耐藥亞群的最高非抑菌濃度至少是原始菌株的最低抑菌濃度的8倍，并且不影響主要敏感群體的生長(zhǎng)[55]。但是并未對(duì)異質(zhì)性耐藥亞群的克隆性以及亞群的發(fā)生頻率進(jìn)行準(zhǔn)確定義，NICOLOFF等研究者則在其基礎(chǔ)上將這兩項(xiàng)因素加入到異質(zhì)性耐藥的表型定義中，他們認(rèn)為存在MIC值至少是原始菌株的8倍且發(fā)生頻率大于1×10-7的耐藥亞群，并且存在臨床上易感的主要群體，則可以確認(rèn)為是異質(zhì)性耐藥[56]。

2.2 異質(zhì)性耐藥的檢測(cè)方法

目前臨床上對(duì)于異質(zhì)性耐藥菌的檢測(cè)沒(méi)有能夠快速檢驗(yàn)的方法，而常用的VITEK 2 Compact系統(tǒng)等藥敏檢測(cè)方法，只能檢測(cè)細(xì)菌的敏感性，不能判定其異質(zhì)性。目前實(shí)驗(yàn)室篩選異質(zhì)性耐藥的方法包括K-B紙片法、E-test試紙條法等，此類方法只能通過(guò)肉眼觀察抑菌圈內(nèi)是否有菌落生長(zhǎng)，如果圈內(nèi)有菌落生長(zhǎng)就判斷為對(duì)該藥物的異質(zhì)性耐藥菌。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作方面簡(jiǎn)單快捷，結(jié)果判定一目了然；但其缺點(diǎn)是目前沒(méi)有判斷標(biāo)準(zhǔn)，只能通過(guò)主觀方面進(jìn)行判斷，不能計(jì)算耐藥亞群出現(xiàn)頻率，而且很有可能因?yàn)榫陮?duì)抗菌藥物敏感性存在差異而遺漏不同群譜。有研究發(fā)現(xiàn)K-B法以及E-test法均存在較高的假陰性率[58]，導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥菌株的漏檢。因此此類方法也不能作為能有效檢測(cè)出細(xì)菌異質(zhì)性的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前菌群譜型分析法(Population Analysis Profiling,PAP)被認(rèn)為是判斷異質(zhì)性耐藥細(xì)菌的金標(biāo)準(zhǔn)[55]，該方法的缺點(diǎn)也十分明顯，花費(fèi)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、且操作繁瑣，只適合實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，不適用于臨床上的快速檢測(cè)。

隨后，EL-HALFAWY等人[55]給出了詳細(xì)的鑒定異質(zhì)性耐藥菌株的方法，首先采用E-test試紙條法、藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行初篩，觀察其抑菌圈內(nèi)是否出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)，如果有，則可以初步鑒定為異質(zhì)性耐藥菌株；如果沒(méi)有，則為耐藥菌株。然后對(duì)初步篩選出來(lái)的異質(zhì)性耐藥菌株進(jìn)行PAP來(lái)作為最終鑒定標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)方案結(jié)合了常規(guī)的判斷異質(zhì)性耐藥菌株的方法，在很大程度上避免可能會(huì)出現(xiàn)的誤差，有效提高了異質(zhì)性耐藥菌株的鑒定效率。但是這種方案也不適用于臨床上進(jìn)行快速檢測(cè)，目前除了上述方案，高通量測(cè)序和微滴式數(shù)字PCR也成為作為檢測(cè)異質(zhì)性耐藥的新一代具有前景的方法[57-58]。但是這種新的技術(shù)在臨床上推廣應(yīng)用存在很多局限性，一方面這種新的方法需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行分析，并且測(cè)試費(fèi)用較高。另一方面由于不同的細(xì)菌和藥物中的異質(zhì)性耐藥的頻率波動(dòng)不同，很多革蘭氏陰性桿菌的異質(zhì)性耐藥比例的最低比例甚至在千萬(wàn)分之一，這種方法也無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)出頻率低于1%的耐藥亞群。此外，雖然基因型和表型之間通常有很好的相關(guān)性，但也存在一些差異，這可能會(huì)使基因分型結(jié)果的分析復(fù)雜化。由于目前還沒(méi)有實(shí)用的方法來(lái)準(zhǔn)確檢測(cè)臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的異質(zhì)性耐藥，開(kāi)發(fā)新的臨床檢測(cè)異質(zhì)性耐藥方法迫在眉睫。

2.3 異質(zhì)性耐藥機(jī)制研究

自1997年首次報(bào)道甲氧西林異質(zhì)性耐藥金黃色葡萄球菌[59]以來(lái)，研究人員已在多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，如肺炎克雷伯菌[60]、肺炎鏈球菌[61]、結(jié)核分枝桿菌[62]、鮑曼不動(dòng)桿菌[63]和幽門螺桿菌[64]等臨床常見(jiàn)致病菌。近年來(lái)關(guān)于PA的異質(zhì)性耐藥[65]也有大量研究，包括頭孢菌素[66]、碳青霉烯[56,67-73]和多粘菌素[74,75]等抗生素，尤以后兩類抗生素研究較多，但目前對(duì)PA異質(zhì)性耐藥機(jī)制的研究仍不夠系統(tǒng)和深入。

目前發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性耐藥機(jī)制比較單一，不同型別的PA異質(zhì)性耐藥機(jī)制也不同，但大多與各類外排泵的過(guò)表達(dá)相關(guān)[70]。IKONOMIDS等人研究發(fā)現(xiàn)PA美羅培南異質(zhì)性耐藥亞群的外排泵MexB和MexY基因表現(xiàn)為上調(diào)，增加了對(duì)抗生素的外排作用，以致細(xì)菌亞群對(duì)美羅培南的耐藥性有所增加[71]。有研究發(fā)現(xiàn)，PA亞胺培南的異質(zhì)性耐藥機(jī)制也與外排泵的過(guò)表達(dá)有緊密聯(lián)系，主要是與外排泵MexAB的過(guò)表達(dá)有關(guān)[72]。表現(xiàn)為替加環(huán)素異質(zhì)性耐藥的沙門菌中，AcrAB和OqxAB外排泵表現(xiàn)為上調(diào)[76]。而在碳青霉烯異質(zhì)性耐藥的銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)Mex B和Mex E外排泵基因上調(diào)合并OprD膜孔蛋白下調(diào)[67]。吳婷婷等人在36株亞胺培南異質(zhì)性耐藥菌株中檢測(cè)出了6株P(guān)A外膜孔蛋白OprD2缺失，另有研究也表明OprD2編碼基因的缺失或插入會(huì)導(dǎo)致菌株對(duì)亞胺培南耐藥性增強(qiáng)[73]。

異質(zhì)性耐藥根據(jù)其耐藥機(jī)制的不同可分為兩種類型，一類是穩(wěn)定性的異質(zhì)性耐藥，另一類是不穩(wěn)定性的異質(zhì)性耐藥。在穩(wěn)定的單克隆異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象中，賦予亞群抗性的頻繁突變包括SNP、插入、缺失和框移，這種突變具有遺傳穩(wěn)定性。因此，即使在沒(méi)有抗生素的情況下，耐藥亞群也不會(huì)迅速回復(fù)到敏感表型，并且在生長(zhǎng)過(guò)程中僅僅表現(xiàn)為很小的適應(yīng)性代價(jià)。在沒(méi)有抗生素的環(huán)境中，不穩(wěn)定性異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象中，一小部分耐藥亞群表現(xiàn)出可逆的抗生素敏感性增加。不穩(wěn)定性異質(zhì)性耐藥機(jī)制主要有兩種：首先，與穩(wěn)定異質(zhì)性耐藥相同的突變耐藥亞群，這些突變?cè)谶z傳上是穩(wěn)定的，但帶來(lái)了很高的適應(yīng)性代價(jià)。在沒(méi)有抗生素的環(huán)境中，高昂的適應(yīng)性代價(jià)是選擇可以降低成本的第二位點(diǎn)補(bǔ)償突變的驅(qū)動(dòng)因素，并且會(huì)伴隨著耐藥表型的丟失，這種耐藥機(jī)制已經(jīng)在氨基糖苷類和碳青霉烯類等抗生素的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象中觀察到[77,56]。另外一種耐藥機(jī)制是通過(guò)自身不穩(wěn)定的串聯(lián)擴(kuò)增序列拷貝而導(dǎo)致對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，這種自發(fā)性基因的串聯(lián)擴(kuò)增也常常不穩(wěn)定，并且會(huì)在沒(méi)有抗生素的情況下丟失耐藥表型。例如，在鼠傷寒沙門菌中，由于pmrD基因的擴(kuò)增促進(jìn)了LPS修飾酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)多粘菌素耐藥[74]。

3 研究展望

PA長(zhǎng)期以來(lái)作為院內(nèi)感染最常見(jiàn)的致病菌，對(duì)于多種抗生素具有較強(qiáng)耐藥性，使得多重耐藥菌也呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。PA對(duì)抗菌藥物耐藥性的增強(qiáng)給臨床治療帶來(lái)了很大挑戰(zhàn)。因此，人們對(duì)PA復(fù)雜多樣的耐藥機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，并取得了一定成果。而對(duì)于PA的治療，探索新的治療方法仍然是至關(guān)重要的。

近年來(lái)隨著多重耐藥菌的日益增長(zhǎng)，異質(zhì)性耐藥也逐漸得到研究學(xué)者的關(guān)注。異質(zhì)性耐藥作為耐藥的一種特殊形式，存在于各類細(xì)菌對(duì)多種抗生素的耐藥現(xiàn)象中，由于耐藥亞群的存在，異質(zhì)性耐藥菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往表現(xiàn)為“假敏感”，臨床上缺少快速檢測(cè)出異質(zhì)性耐藥菌株的方法，不能對(duì)其做出準(zhǔn)確的判斷，醫(yī)生不能正確地用藥，從而延誤病情，導(dǎo)致反復(fù)感染和治療失敗。異質(zhì)性耐藥被認(rèn)為是細(xì)菌逐漸進(jìn)化為耐藥的一種工具，在長(zhǎng)期抗生素壓力環(huán)境下，能適應(yīng)較高抗生素濃度的亞群不斷增加，如果不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，這類菌株將對(duì)抗生素完全耐藥。因此，及時(shí)有效的對(duì)異質(zhì)性耐藥菌株進(jìn)行防控顯得尤為重要，相關(guān)耐藥機(jī)制研究任重而道遠(yuǎn)。

由于PA廣泛存在于環(huán)境當(dāng)中，十分容易感染，所以各種廣譜抗菌劑以及消毒劑的使用在預(yù)防和控制細(xì)菌感染中發(fā)揮十分重要的作用，尤其是在控制PA的感染過(guò)程中顯得尤為重要。除了上述在臨床上發(fā)現(xiàn)的抗生素異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象以外，本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，在工業(yè)抗菌劑以及消毒劑的使用過(guò)程中，多種細(xì)菌出現(xiàn)對(duì)抗菌劑敏感性降低的細(xì)菌亞群，但在沒(méi)有抗菌劑壓力的條件下多次傳代后敏感性又恢復(fù)的現(xiàn)象。這類現(xiàn)象在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等常見(jiàn)細(xì)菌中均有出現(xiàn)，這其實(shí)也是一種細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，是細(xì)菌對(duì)工業(yè)殺菌劑的異質(zhì)性耐藥。但是細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥在工業(yè)抗菌領(lǐng)域并未引起足夠重視，這極大的促進(jìn)了工業(yè)抗菌劑耐藥菌和多重耐藥菌的發(fā)生，給工業(yè)抗菌領(lǐng)域造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在工業(yè)抗菌領(lǐng)域也要對(duì)異質(zhì)性耐藥細(xì)菌引起足夠的重視，搞清異質(zhì)性耐藥細(xì)菌的發(fā)生機(jī)制，有效防控異質(zhì)性耐藥細(xì)菌的發(fā)生和發(fā)展十分重要。