張雅檬，寧 雪，姚柳葉，錢志余，李韙韜*

（1.南京航空航天大學生物醫(yī)學工程系，南京 210016；2.南京工程學院計算機工程學院，南京 211167）

0 引言

大腦是人體最重要也是最復雜的器官，作為軀體其他器官的控制中樞，腦功能的正常發(fā)揮依賴于神經(jīng)活動和血流動力學的緊密聯(lián)系。腦組織通過血液循環(huán)來獲得氧氣和葡萄糖等。由于大腦各功能區(qū)激活時對腦區(qū)能量供給有差異性要求，因此腦血液供應需要達到較高要求，否則將造成嚴重后果[1]。一方面，大腦血液供應完全中斷超過幾分鐘，如當中風阻塞腦動脈或心臟驟停出現(xiàn)泵衰竭時，會導致無法挽回的腦損傷甚至腦死亡；另一方面，血流減少到與腦組織能量需求不匹配后，就會導致大腦細微變化，從而導致與認知障礙相關的易發(fā)區(qū)慢性腦損傷[2]。因此，人們長期致力于研究大腦神經(jīng)活動與血流動力學的關系，即神經(jīng)血管耦合。

隨著科技的進步，多學科交叉融合為腦科學的發(fā)展提供了新的手段。其中，光-電信號裝置作為神經(jīng)科學研究的重要手段，具有較好的時間-空間分辨力，并可從微觀的神經(jīng)元研究跨到宏觀的血流動力學研究，多尺度、多模態(tài)地研究大腦神經(jīng)血管耦合。因此，本文重點介紹光-電信號裝置及其在神經(jīng)血管耦合中的研究進展，探討光-電信號裝置應用于神經(jīng)血管耦合研究的優(yōu)勢和局限性，以期為腦疾病診斷和療效評估提供一個新的方向。

1 神經(jīng)血管耦合的研究進展

神經(jīng)血管耦合指的是大腦的神經(jīng)電位活動與血管之間的動態(tài)信息交流機制，其結構包含神經(jīng)元細胞、星形膠質細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞等組織，強調血流與神經(jīng)細胞兩者之間的緊密聯(lián)系[3]。神經(jīng)血管耦合的研究始于19 世紀晚期，如圖1 所示[4]。早在1890 年，Roy 等[4]觀察到腦窒息或腦低氧期間釋放出的代謝產(chǎn)物會擴張腦血管。1950 年，F(xiàn)regang等[5]通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)腦代謝底物和腦血流量之間存在耦合效應，并提出了神經(jīng)血管耦合的假說。自此，大量神經(jīng)血管耦合的研究逐漸展開。2001 年，神經(jīng)血管耦合在國際神經(jīng)科學大會上由腦卒中評估小組正式提出并確立后，呈現(xiàn)井噴式發(fā)展，基于神經(jīng)血管耦合主題的文獻數(shù)量由2001 年的不足100 篇發(fā)展到2017 年的6 500 多篇[6]。自此，神經(jīng)血管耦合吸引了神經(jīng)科學家的目光，而后在技術、方法和理論上都取得了長足的進步，并廣泛應用于大腦認知功能的各方面以及多種神經(jīng)功能疾病的研究。

圖1 神經(jīng)血管耦合概念的研究發(fā)展史[4]

在神經(jīng)退行性疾病研究中，Thomas 等[7]發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白造成神經(jīng)元的表達障礙，且損傷內皮細胞造成血管收縮，加劇阿爾茨海默癥的癥狀。隨后Niwa 等[8]發(fā)現(xiàn)不同組別小鼠腦血管的功能性充血程度與大腦中的Aβ 蛋白含量相關，即Aβ 蛋白調節(jié)神經(jīng)血管單元中的內皮功能并改變腦血流量。Martin 等[9]發(fā)現(xiàn)額顳葉癡呆的主要特征是星形膠質細胞的增生和損傷，且星形膠質細胞的退化與腦血流量呈負相關，說明膠質細胞的損傷與血流速度直接相關。Guan 等[10]在研究帕金森病晚期時，發(fā)現(xiàn)內皮細胞核的損傷會導致毛細微血管的通透性變大。在腦功能研究中，劉睿旭等[11]通過對側運動區(qū)的重復經(jīng)顱磁刺激，發(fā)現(xiàn)腦功能區(qū)興奮性與神經(jīng)血管耦合相關，通過改變刺激電極的電流頻率，激活了大鼠腦功能區(qū)并發(fā)現(xiàn)相應腦區(qū)血氧消耗明顯增加。

綜上所述，血腦屏障的損傷可造成神經(jīng)血管耦合特性改變，引起腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和認知障礙等發(fā)生，威脅人類健康。通過光-電信號裝置研究神經(jīng)血管耦合對于疾病監(jiān)測和神經(jīng)科學發(fā)展具有重要意義，因此，本文重點對此進行綜述。

2 光-電信號裝置及其在神經(jīng)血管耦合中的研究進展

2.1 電生理信號采集系統(tǒng)

電生理信號采集系統(tǒng)一般由神經(jīng)信號放大器、信號處理器、穩(wěn)壓電源和微電極等組成。當微電極被植入動物腦區(qū)后，動物腦功能區(qū)的神經(jīng)元電位信號可通過信號放大器放大，再經(jīng)由模數(shù)轉換器轉換為數(shù)字信號，通過濾波去噪等信號處理獲取神經(jīng)元場電位信號和神經(jīng)元鋒電位信號。目前，比較成熟的電生理信號采集系統(tǒng)有Blackrock 公司的Cerebus 多通道神經(jīng)信號采集系統(tǒng)和Plexon 公司的OmniPlex在體多通道神經(jīng)信號采集系統(tǒng)[12]。

在電生理信號采集中，微電極作為記錄神經(jīng)信號的最初傳感端，是電生理信號采集系統(tǒng)的關鍵裝置。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)多種不同類型的微電極。金屬絲微電極從20 世紀中期開始就被應用于記錄神經(jīng)元電信號，是最常見的微電極之一[13]。金屬絲微電極陣列具有體積小、記錄點多、植入方便等優(yōu)點，可廣泛應用于在體大鼠等哺乳類動物神經(jīng)元場電位信號和鋒電位信號的記錄。

常用微電極陣列分為水平型和垂直型2 種，水平型記錄點位于記錄桿的尖端，適合用于大腦皮層淺表組織的神經(jīng)信號檢測；垂直型記錄點依次排列在記錄桿上，適合于深部腦組織的記錄，其中Utah電極和Michigan 電極最典型[14-15]。Utah 電極（如圖2所示）在4 mm×4 mm 的硅基板上集成了100 根針形微電極，每根電極軸長度為1.5 mm，尖端由鉑金包裹，阻抗范圍為100～800 kΩ，電極軸的間距為400 μm，該電極主要應用于神經(jīng)修復和腦機接口[16]。

Przedborski[17]通過微電極裝置植入腦干，發(fā)現(xiàn)特發(fā)性帕金森病中運動功能障礙和認知障礙都始于腦干的黑紋狀體傳導路徑，且進一步研究發(fā)現(xiàn)膠質細胞活動導致與其接觸的內皮細胞功能異常。Voytek等[18]通過電生理信號采集系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)大鼠AD 模型中腦干-前腦基底節(jié)、丘腦-皮層、皮質半球內-半球間3 個通路神經(jīng)的鋒電位發(fā)放都存在去耦合現(xiàn)象。此外，通過腦功能成像裝置的聯(lián)合研究，研究人員發(fā)現(xiàn)神經(jīng)信號通過神經(jīng)血管耦合直接或間接作用于局部血管來調節(jié)腦血流量，以維持腦微循環(huán)平衡，如黃明亮[19]采用微電極陣列和內源光信號裝置研究了體感運動區(qū)的神經(jīng)血管耦合，利用格蘭杰因果分析提出了神經(jīng)調控關系。

圖2 Utah 電極[16]

總之，電生理信號采集系統(tǒng)的發(fā)展使大腦神經(jīng)的系統(tǒng)研究逐漸深入到細胞層次，該系統(tǒng)是揭示神經(jīng)血管耦合機理、治療神經(jīng)疾病和促進神經(jīng)康復的重要工具。

2.2 光子顯微熒光成像系統(tǒng)

光子顯微熒光成像的原理是神經(jīng)元通過熒光指示劑和膜蛋白的結合，能夠直接測量顯示神經(jīng)元上膜電壓的變化，但并不是所有的指示劑都具有良好的信噪比，目前應用最為廣泛的測量神經(jīng)元活動的指示劑是鈣離子指示劑。1990 年，Denk 團隊開發(fā)了世界上第一臺雙光子激光掃描顯微鏡，其可對神經(jīng)元活動成像，此后光子熒光成像就以其侵入性低、穿透性高、空間分辨力高等優(yōu)勢走進人們的視野[20]。

近年來，隨著熒光標記物和顯微成像技術的不斷發(fā)展，光子顯微熒光成像系統(tǒng)也在高速發(fā)展。根據(jù)其采用的主要技術原理，大體分為如下幾類：光片顯微熒光成像系統(tǒng)、單光子顯微熒光成像系統(tǒng)、多光子顯微熒光成像系統(tǒng)以及在這些基礎上加以改進的成像系統(tǒng)。其中以雙光子顯微熒光成像系統(tǒng)應用于神經(jīng)科學領域最為廣泛和普遍。當前，商用比較出名的是Inscopix 公司的nVoke 單光子顯微熒光成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)可同時結合光遺傳學中的神經(jīng)光調控和大視野鈣離子成像[21]。

2011 年，Truong 等[22]首次提出雙光子光片顯微鏡的概念并在實驗中驗證了其在空間分辨力、成像深度和成像速度方面的優(yōu)勢。2014 年，Zong 等[23]發(fā)明了高分辨力下最大成像視場的三軸掃描雙光子光片顯微鏡系統(tǒng)，如圖3 所示。Kim 等[24]使用雙光子顯微熒光成像系統(tǒng)進行大視場成像，通過人造的水晶顱骨片同時觀測到最多30～40 個神經(jīng)元腦區(qū)，達到了亞細胞級別的分辨力，揭示了自由活動小鼠清醒狀態(tài)下的神經(jīng)鈣離子動態(tài)活動。Li 等[25]通過雙光子顯微熒光鈣離子成像，結合在體光纖系統(tǒng)，在簡單聽覺聯(lián)想測試實驗中首次驗證了聽覺皮層Au1 區(qū)的小鼠預期行為反應，并將其應用于神經(jīng)血管耦合的研究。

當前，光子顯微熒光成像系統(tǒng)已被越來越多地應用到神經(jīng)科學領域中，以其高空間分辨力和固有的光學層析能力的優(yōu)點可實現(xiàn)亞細胞級別的多種熒光團的實時動態(tài)監(jiān)測，可對生物組織功能精確定量表征，是神經(jīng)血管耦合研究取得突破的重要研究系統(tǒng)之一。

圖3 三軸掃描雙光子光片顯微鏡系統(tǒng)光路示意圖[23]

2.3 激光散斑成像系統(tǒng)

激光散斑是一種光學干涉相關現(xiàn)象，散斑圖案形成是因為受激光照射的物體表面會隨機產(chǎn)生散射的顆粒狀圖樣，并且物體表面的顆粒移動會導致散射光的相位平移，進而改變隨機干涉模式，從而造成散射顆粒形成特有的動態(tài)散斑。自20 世紀90 年代以來，研究人員通過改進激光散斑成像系統(tǒng)，將其應用于生物流速檢測的成像領域[26]。

1981 年，F(xiàn)ercher 等[27]基于散射特性首先將洛倫茲譜型的速度分布應用于激光散斑襯比成像技術。目前，比較成熟的激光散斑成像系統(tǒng)是英國MoorLab公司的血流成像系統(tǒng)和瑞典Perimed 公司的激光多普勒成像系統(tǒng)[28-29]。激光散斑成像系統(tǒng)一直在改進之中。Qiu 等[30]通過改進相機的曝光時間、暗噪聲以及采用線陣掃描算法，提高散斑成像的分辨力和運算速度，改進了成像系統(tǒng)，并將其運用在大鼠擴散性皮層抑制（cortical spreading depression，CSD）的研究中，發(fā)現(xiàn)CSD 過程中胞內pH 會經(jīng)歷一個快速酸化及小幅堿化的變化過程，并伴隨有軟腦膜動脈血管的舒張、皮層的充血、腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）和含氧血紅蛋白（HbO2）、脫氧血紅蛋白（HbR）濃度的改變。Miao 等[31]采用嵌入式處理器和電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）設計了一種微型化激光散斑成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以固定在研究動物的身上，可用于觀測清醒狀態(tài)下大鼠的血流速度。Yuan 等[32]通過激光散斑成像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)腦中風導致的CSD 會引起腦血流量變化。Sivakumar 等[33]采用高幀頻相機改進了多曝光激光散斑成像系統(tǒng)，該高幀頻相機的傳感器以全局快門的模式運行，以超過30 f/s 的幀率采集圖像，其血流成像圖像可達到視頻合成的時間分辨力。

2.4 內源光信號成像系統(tǒng)

光學內源信號是指在不對組織施加外源染料情況下，組織本身的自發(fā)光學特性改變而被采集到的信號。腦組織的吸收特性和多種生色團有關，包括HbO2、HbR、細胞內細胞色素氧化酶、神經(jīng)遞質等。腦區(qū)神經(jīng)活動會引起局部HbO2和HbR 濃度的變化，從而改變腦組織的吸收特性，因此光學內源信號是對神經(jīng)元電活動的間接表達。

多光譜內源光信號成像系統(tǒng)主要包括寬帶光源、濾光片、立體顯微鏡頭和CCD 相機。在成像采集中，可通過改變?yōu)V光片來改變實驗中的照射光波長。目前，尹翠[34]采用液晶可調諧濾波器（liquid crystal tunable filter，LCTF）將采樣時間縮短到50 ms 以內，且可在400～720 nm 波長范圍內以1 nm 步長隨意轉換，實現(xiàn)自動控制濾光片，并設計了實時內源光信號的高速采集系統(tǒng)，首次同時監(jiān)測到小鼠在體CSD 過程中HbO2、HbR、黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenosine dinucleotide，F(xiàn)AD）、細胞色素氧化酶的變化。Schwartz 等[35]通過設計2 條獨立的掃描臂，采用分時復用共享光纖和光學器件，可相對同步地采集血液動力學中的氧分壓[p（O）2]、腦血流量、HbO2、HbR 以及還原型輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和鈣離子波動，如圖4 所示。

圖4 多模態(tài)光學設備圖[35]

內源光信號成像系統(tǒng)的研究主要集中在神經(jīng)功能活動方面，特別是針對神經(jīng)血管耦合的研究。1949年，Hill 等[36]首先在離體的海蟹神經(jīng)纖維上觀察到神經(jīng)活動，并發(fā)現(xiàn)其會造成光散射的增強。隨后，Cohen等[37]在分離的神經(jīng)纖維上發(fā)現(xiàn)光散射增強與魷魚軸突的動作電位相關。Lu 等[38]通過提高內源光信號成像系統(tǒng)的時間分辨力，成功采集到實驗猴視覺刺激后的神經(jīng)活動反應和血流的瞬時關聯(lián)反應，說明高時空分辨力的內源光信號裝置可應用于清醒狀態(tài)下動物行為實驗瞬時反應研究。同時，內源光信號成像系統(tǒng)也應用于臨床相關的病例學研究。Schwartz 等[39]應用神經(jīng)遞質阻斷劑誘導雪貂皮層癲癇的模型，在體研究內源光信號成像結果，與光學成像同時進行的電生理記錄證實了所記錄到的光反射信號變化在空間上與產(chǎn)生放電神經(jīng)元的總量相關，且實驗結果與采用功能性磁共振成像（functional magnetic resonance imaging，fMRI）等技術在人體癲癇病灶變化中的研究結果有很好的一致性。胡學斌[40]利用多光譜內源光信號系統(tǒng)研究了大鼠CSD 的產(chǎn)生、發(fā)展和傳播過程，并結合電生理信號采集系統(tǒng)驗證了CSD 對大鼠腦缺血性損傷的保護作用。

2.5 光聲成像系統(tǒng)

光聲成像是一種較新的成像方法，其基于光聲效應原理，無創(chuàng)地獲取物體二維斷層或三維立體的成像。光聲效應是指物體受到短脈沖高強度激光照射后，物體內部將會產(chǎn)生周期性變化的現(xiàn)象，并可被超聲探頭探測。目前，已上市的光聲成像系統(tǒng)有美國TomoWave 公司的小動物成像系統(tǒng)[41]和德國iThera Medical 公司的醫(yī)用光聲成像系統(tǒng)[42]。

光聲成像由于無創(chuàng)、無輻射且具有較高分辨力的特點，是近年來人們研究的熱點。Zhang 等[43]將高分辨力（150 μm 空間分辨力）光聲成像系統(tǒng)首次應用于癲癇病發(fā)作的成像中，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)神經(jīng)成像方式相比，其具有超高的空間分辨力。Li 等[44]采用高強度近紅外染料標記間充質干細胞，通過采用光聲成像系統(tǒng)研究了腦屏障通透性和小鼠腦損傷恢復性，發(fā)現(xiàn)腦損傷恢復與神經(jīng)血管耦合相關，如圖5 所示。楊思華等[45]通過搭建一套旋轉掃描光聲成像采集系統(tǒng)對腦損傷動物進行在體成像檢測研究，并進一步定量腦損傷程度與血腦屏障的關聯(lián)性。Bi 等[46]通過光聲成像系統(tǒng)觀察了康普瑞啶磷酸二鈉作用于腦內接種原位膠質瘤的小鼠，通過對神經(jīng)元、膠質細胞和血管壁的神經(jīng)血管耦合單元監(jiān)測，從而驗證出該藥物對于神經(jīng)微血管的血管關閉和恢復調控作用。

圖5 顱腦損傷后小鼠的自然恢復過程檢測[44]

血液中的血紅蛋白是可見光和近紅外范圍波段的主要吸收物質，采用該波段激光的光聲成像技術可應用于腦血管結構和功能研究中。Hu 等[47]采用三脈沖激發(fā)光建立快速光聲顯微鏡系統(tǒng)，可同時采集到血紅蛋白濃度、血流速度和血氧飽和度。Liu 等[48]基于拉曼散射單波長改進光聲成像系統(tǒng)，可同時對血管結構和HbO2濃度成像，并可實現(xiàn)腦微血管動靜脈分割。

2.6 光-電信號聯(lián)合系統(tǒng)

為了深入探究神經(jīng)血管耦合，多模態(tài)光-電信號聯(lián)合系統(tǒng)被應用于動物模型。Liu 等[49]將16 通道微電極與功能光聲成像集成為μECoG-fPAM 系統(tǒng)，同步測定神經(jīng)元發(fā)放和血流動力學參數(shù)，用來研究腦缺血模型的神經(jīng)血管耦合。Baker 等[50]利用激光散斑成像系統(tǒng)和內源光信號成像系統(tǒng)研究前肢刺激大鼠模型的腦血流量、血氧值、代謝產(chǎn)物，并通過瞬時誘發(fā)電位分析各參數(shù)的耦合關系。Wang 等[51]將光聲傳感器技術和腦電圖技術集成到一個小型便攜式設備，可以連接在自由活動的喚醒動物頭上，這是首次自由活動動物癲癇發(fā)作的血流動力學監(jiān)測研究。Liao等[52]采用腦皮層信號與功能光聲顯微成像技術研究大鼠的局灶性腦缺血的神經(jīng)血管耦合特性，發(fā)現(xiàn)血紅蛋白總量、腦血容量和血氧飽和度的改變與小動脈誘導的卒中相關，并證明了該聯(lián)合技術研究小動物腦缺血模型的優(yōu)越性。

綜上所述，光-電信號聯(lián)合系統(tǒng)測量神經(jīng)元活動和血流動力學參數(shù)能夠在時空上反映出對于多種物理刺激或者藥物作用下神經(jīng)血管耦合各參數(shù)的瞬時響應，動態(tài)觀測到大腦的神經(jīng)活動、能量交換甚至病理變化，為神經(jīng)科學研究中認知障礙、神經(jīng)退行性疾病和腦血管疾病診斷和監(jiān)測提供了技術手段。

3 結語

光-電信號裝置發(fā)展至今已有50 多年的歷史，已發(fā)展出多種成像方法，可實時同步地觀測神經(jīng)血管中神經(jīng)信號、血流動力學等參數(shù)的瞬時響應，從不同的空間和時間尺度上研究腦功能活動，突破了傳統(tǒng)的影像學方法的時間分辨力較低的局限性，對于神經(jīng)血管耦合及其相關疾病機理研究有重要意義，并為腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和認知障礙等疾病的診斷提供了一種全面的技術支持。

相較于傳統(tǒng)的離體免疫組化和影像學設備，光-電信號裝置依然有其局限和不足。由于光顱骨穿透性和電生理信號的放大問題，在采用光-電信號裝置研究神經(jīng)血管耦合時，依然需要有創(chuàng)操作甚至開顱，這對于長期研究腦血管疾病的動物模型以及進一步臨床疾病監(jiān)測具有很大的限制性；此外，腦皮層組織作為一種獨特的高散射混濁介質，光學系數(shù)如光源和入射角度的改變都會對系統(tǒng)成像的信噪比有影響，導致獲得的個體信號強度存在較大差異性，并且獲得的圖像和信號定標存在一定困難，甚至很難定量分析神經(jīng)血管耦合參數(shù)；同時對于需要熒光標記使用的光子顯微熒光成像，其關鍵核心依然是熒光蛋白標記，因此很難應用于臨床研究。

隨著神經(jīng)科學和工程科學的發(fā)展以及光學材料的改進和技術進步，光-電信號裝置的成像深度、時間分辨力和空間分辨力都將會逐步提高，從而建立神經(jīng)血管耦合的量化模型，為在體腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和認知障礙疾病的監(jiān)測和診斷提供指導方案。由于神經(jīng)血管耦合中神經(jīng)細胞、內皮細胞和血管細胞相互作用，其分子間復雜協(xié)調工作尚不明確，采用光-電信號聯(lián)合系統(tǒng)和傳統(tǒng)方法共同研究，通過建立特定神經(jīng)血管耦合參數(shù)與生化組織參數(shù)的關聯(lián)量化模型，可為神經(jīng)血管耦合研究提供新的思路。另外，不同模態(tài)的光-電信號技術更新也會促進光-電信號聯(lián)合系統(tǒng)的融合和發(fā)展，從不同尺度觀測大腦的神經(jīng)活動、能量交換甚至病理變化，從而為神經(jīng)科學研究中的認知障礙、神經(jīng)退行性疾病和腦血管疾病機理研究和臨床監(jiān)測提供新的方向和工具。