何錫然，譚曉宇，張 琳，劉華敏，鄺偉鍵，梁銘炬，周偉津，郭家钘，陳素平，霍 楓*

（1.廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院）生物醫(yī)學(xué)部，廣東佛山 528311；2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，廣州 510010；3.廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司研發(fā)部，廣東佛山 528311）

0 引言

對(duì)于終末期肝臟疾病患者，肝移植已成為唯一有效的治療手段[1]。目前全球已有200 余個(gè)肝移植中心，迄今已完成累積超過10 萬余例肝移植手術(shù)，并且每年以8 000～10 000 例次的速度遞增[2]。臨床肝移植的快速發(fā)展使供肝短缺的情況日趨嚴(yán)重。目前，供肝短缺的情況迫使臨床醫(yī)生更多地使用缺血損傷肝臟等邊緣供肝。但是來源于邊緣供體的器官可能引起更高的移植物早期功能障礙、原發(fā)性無功和肝內(nèi)膽管并發(fā)癥等的發(fā)生率[3-4]，從而影響患者的長(zhǎng)期生存率。同時(shí)，邊緣供體的器官對(duì)冷保存相關(guān)的缺血損傷更加敏感[5]。因此，在器官供應(yīng)短缺的情況下，這種高危供體器官的使用仍然有限。鑒于此，肝移植領(lǐng)域需要一種新的器官保存技術(shù)。低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）在4 ℃下提供持續(xù)的循環(huán)灌注，可以提供代謝底物和去除代謝廢物。研究表明，HMP 結(jié)合供氧能夠恢復(fù)細(xì)胞的能量水平，減緩再灌注損傷時(shí)的線粒體損傷和活性氧釋放[4]。目前，已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段的肝臟HMP 設(shè)備有荷蘭Organ Assist公司的Liver Assist[6-7]和美國(guó)Organ Recovery Systems公司[8-9]的LifePort Liver Transporter。對(duì)于攜氧低溫灌注，目前產(chǎn)品化比較成功的設(shè)備是Liver Assist，該設(shè)備的肝動(dòng)脈和門靜脈均采用壓力控制模式。但是該設(shè)備運(yùn)輸受限，供肝獲取后需要經(jīng)靜態(tài)冷保存運(yùn)輸至移植中心后才能連接設(shè)備進(jìn)行灌注，因此為了避免冷缺血時(shí)間過長(zhǎng)，使用Liver Assist 的灌注時(shí)間需要控制在1～2 h。但是靜態(tài)冷保存結(jié)合短時(shí)間低溫灌注的模式不適合幅員遼闊的中國(guó)國(guó)情，因此本項(xiàng)目組構(gòu)建了一臺(tái)離體肝臟雙泵雙氧合機(jī)械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000，是兼具常溫機(jī)械灌注與HMP 的離體機(jī)械灌注設(shè)備。本設(shè)備對(duì)門靜脈的控制采用恒流模式，且設(shè)備將計(jì)劃應(yīng)用于救護(hù)車，故未來的應(yīng)用模式為器官獲取組織在臨床上獲取供肝后，首先進(jìn)行修肝，然后連接設(shè)備，隨后放置于救護(hù)車上，轉(zhuǎn)運(yùn)至移植中心。這種模式能夠縮短靜態(tài)冷保存的時(shí)間，延長(zhǎng)攜氧低溫灌注的時(shí)間，更好地改善肝細(xì)胞的缺氧情況，減輕移植后的再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)研究為設(shè)備研發(fā)的初始階段，目的是驗(yàn)證設(shè)備的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)時(shí)間攜氧低溫灌注的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康巴馬小型豬3 只，雌性，體質(zhì)量45～50 kg，由南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)豬在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，禁止飲水6 h。實(shí)驗(yàn)操作過程均符合動(dòng)物中心的倫理要求。

灌注設(shè)備：離體肝臟雙泵雙氧合機(jī)械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000，由廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院）、南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院、廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司聯(lián)合研發(fā)，可以對(duì)離體肝臟進(jìn)行肝動(dòng)脈和門靜脈雙重氧合灌注。該灌注設(shè)備主要包括：2 個(gè)離心泵（Revolution，索林集團(tuán)意大利有限公司）、2 個(gè)氧合器（EU5032 Trilly 嬰兒型，意大利Eurosets）、1 個(gè)溫度傳感器、2 個(gè)壓力傳感器、2 個(gè)流量傳感器、2 個(gè)血栓過濾器、1 個(gè)溫控水箱，以及自制的儲(chǔ)肝器、灌注管路、膽管插管等，通過管路連接形成肝動(dòng)脈循環(huán)和門靜脈循環(huán)。其原理圖如圖1 所示。

圖1 離體肝臟雙泵雙氧合機(jī)械灌注設(shè)備原理圖

實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：呼吸機(jī)（S1100 型，南京舒普思達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司）、多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀（M-9000S，深圳市艾瑞康醫(yī)療設(shè)備有限公司）、全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（IMS-70，常熟市圣海電器有限公司）、全自動(dòng)生化分析儀（Pointcare M3，天津微納芯科技有限公司）、血?dú)夥治鰞x（i-STAT300，Abbott Point of Care Inc）、電子稱（HY-809B，至尊）、一次性醫(yī)用靜脈留置針（24G，江西豐臨醫(yī)用器械有限公司），導(dǎo)尿管（16Fr雙腔，湛江事達(dá)實(shí)業(yè)有限公司）、硫酸阿托品注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司）、舒泰50（法國(guó)維克有限公司）、丙泊酚乳狀注射液（西安力邦制藥有限公司）、氯化鉀注射液（湖北科倫藥業(yè)有限公司）、高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液（上海輸血技術(shù)有限公司）、UW 機(jī)械灌注液（美國(guó)Bridge to Life 公司）、肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司）、注射用頭孢西丁鈉[國(guó)藥集團(tuán)致君（深圳）制藥有限公司]、豬IL-6 ELISA 試劑盒（ELP-IL6，RayBio）、豬TNF-α ELISA試劑盒（ELP-TNF-α，RayBio）以及組織固定液（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)為單臂設(shè)計(jì)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝臟均采用離體HMP，用于驗(yàn)證離體肝臟雙泵雙氧合機(jī)械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000 的可操作性及穩(wěn)定性。

1.3 豬肝臟的獲取

耳后肌內(nèi)先注射硫酸阿托品注射液0.05 mg/kg，15 min 后注射舒泰50 溶液2～3.5 mg/kg 進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉?；A(chǔ)麻醉后，豬耳緣靜脈留置套管針，建立靜脈輸液通道，利用微量注射泵每小時(shí)泵入丙泊酚乳狀注射液2～5 mg/kg 維持麻醉。進(jìn)行氣管插管，利用呼吸機(jī)輔助呼吸。腹部正中線切口進(jìn)腹，切口上抵胸骨劍突，下達(dá)恥骨聯(lián)合，游離腹主動(dòng)脈、下腔靜脈及門靜脈。耳緣靜脈注射1 g 氯化鉀注射液，使心臟驟停。靜置實(shí)驗(yàn)豬60 min，建立熱缺血60 min 模型。60 min 后，結(jié)扎胸主動(dòng)脈，向腹主動(dòng)脈置入已剪開口的16Fr 導(dǎo)尿管進(jìn)行在體冷灌注，灌注液為4 ℃的高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液，體積為1 L；同時(shí)進(jìn)行門靜脈插管，剪開肝靜脈出口進(jìn)行在體冷灌注，灌注液為4 ℃的高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液，體積為1 L。快速取下肝臟，將其置入裝有4 ℃生理鹽水的容器。修整肝門區(qū)域多余組織，剔除肝門區(qū)域的淋巴結(jié)，進(jìn)行肝動(dòng)脈和膽道插管，隨后記錄肝臟質(zhì)量。

1.4 HMP

開始灌注之前，灌注管路內(nèi)用1.5 L UW機(jī)械灌注液進(jìn)行預(yù)充，排除管路中的氣泡。隨后加入6 250 U 肝素鈉注射液和1 g 注射用頭孢西丁鈉，開始接通氧氣瓶。肝臟連接設(shè)備，灌注溫度為4 ℃，氧氣體積分?jǐn)?shù)為100%。肝動(dòng)脈采用壓力控制模式，設(shè)定為25 mmHg（1 mmHg=133.32 Pa）；門靜脈采用流量控制模式，設(shè)定為0.5 mL/[min·g（肝重）]。在灌注過程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)肝動(dòng)脈流量及門靜脈壓力，灌注時(shí)間為8 h。

1.5 監(jiān)測(cè)項(xiàng)目

在灌注過程中，觀察設(shè)備的穩(wěn)定性，記錄灌注流量與灌注壓力。同時(shí)每2 h 取灌注液行血?dú)夥治?，觀察pH 值、血糖（Glu）和乳酸（Lac）水平。另外，在灌注的第0、2、4、6、8 h 分別從肝上隨機(jī)選取2 份樣品，一份組織樣本進(jìn)行白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平的檢測(cè)，另一份進(jìn)行組織學(xué)檢查，用福爾馬林固定后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE 染色）。根據(jù)鈴木評(píng)分[10]以及其他文獻(xiàn)結(jié)果[11-13]，從空泡化、壞死、水腫以及肝竇擴(kuò)張方面進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)方面分為無、輕度、中度和重度，分別評(píng)分0、1、2、3 分；每張切片隨機(jī)選取3 個(gè)視野進(jìn)行雙人評(píng)分，最后統(tǒng)計(jì)每項(xiàng)得分。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS Statistics 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所有計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 肝臟灌注前的情況

灌注前肝臟平均質(zhì)量為（888.00±41.33）g，獲取肝臟后需要（69.33±3.38）min 進(jìn)行修肝。

2.2 灌注參數(shù)

灌注過程中，設(shè)備沒有出現(xiàn)故障。肝動(dòng)脈的壓力穩(wěn)定維持在24.09～24.65 mmHg，肝動(dòng)脈流量則從灌注初期的0.04 mL/[min·g（肝重）]逐漸升高至0.09 mL/[min·g（肝重）]。門靜脈的流量穩(wěn)定維持在0.47～0.50 mL/[min·g（肝重）]，灌注初期平均門靜脈壓力為2.79 mmHg，灌注最后1 h 平均門靜脈壓力為1.84 mmHg，呈下降趨勢(shì)，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 攜氧HMP 的灌注參數(shù)

2.3 灌注液的血?dú)饨Y(jié)果

從灌注初期至灌注結(jié)束，灌注液的pH 值維持在7.16～7.19；對(duì)于Lac 水平，灌注初期為（0.63±0.21）mmol/L，隨后穩(wěn)定在1.31 mmol/L 左右；Glu 水平則在7.83～9.13 mmol/L。灌注液的血?dú)饨Y(jié)果如圖3所示。

2.4 肝組織IL-6 以及TNF-α 的變化

灌注初期肝組織的IL-6 的平均值為665.97pg/mL，灌注結(jié)束時(shí)平均值為606.91 pg/mL。對(duì)于TNF-α 水平，灌注初期平均值為0.038 ng/mL，灌注結(jié)束時(shí)平均值為0.050 ng/mL，結(jié)果如圖4 所示。

圖3 灌注液的血?dú)饨Y(jié)果

圖4 肝組織的IL-6 以及TNF-α 水平

2.5 肝組織的病理學(xué)及外觀評(píng)價(jià)

肝組織的空泡化評(píng)分呈下降趨勢(shì)，從灌注初期的（2.44±0.40）分下降至灌注結(jié)束時(shí)的（1.00±0.33）分。而肝組織的壞死評(píng)分則在灌注結(jié)束時(shí)輕度升高，灌注初期為（1.22±0.15）分，灌注結(jié)束時(shí)為（1.58±0.42）分。肝細(xì)胞水腫評(píng)分在灌注前后變化輕微，灌注初期為（1.38±0.29）分，灌注結(jié)束時(shí)為（1.33±0.67）分。對(duì)于肝竇擴(kuò)張?jiān)u分，灌注結(jié)束時(shí)為（1.66±0.33）分，比灌注初期（[1.50±0.25）分]輕度升高。肝組織的病理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果如圖5 所示，灌注過程的肝臟外觀如圖6 所示。

3 討論

圖5 肝組織的病理學(xué)評(píng)價(jià)

圖6 灌注過程的肝臟外觀

隨著我國(guó)公民器官捐獻(xiàn)工作的開展和器官需求的不斷增加，我國(guó)的器官移植技術(shù)需要向高質(zhì)量發(fā)展，使更多等待移植的患者受惠，因此各地的器官獲取中心需要比傳統(tǒng)靜態(tài)冷保存更先進(jìn)的技術(shù)用于器官保存。HMP 是目前興起的器官保存技術(shù)之一。相關(guān)研究的臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明，HMP 能夠恢復(fù)肝細(xì)胞的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平，減輕移植再灌注損傷，降低移植物早期功能障礙發(fā)生率，同時(shí)使膽管并發(fā)癥發(fā)生率下降，縮短住院時(shí)間和提高移植物存活率[6-9，14-15]，這均提示其具有良好的應(yīng)用前景。目前，國(guó)外已有關(guān)于HMP 技術(shù)應(yīng)用于臨床肝移植的報(bào)道，如Liver Assist[6-7]和LifePort Liver Transporter[8-9]的應(yīng)用。本研究中的HMP 設(shè)備為國(guó)內(nèi)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的DEVOCEAN-LIVER 2000，具有產(chǎn)品化的設(shè)計(jì)，并配備完整的耗材，未來可應(yīng)用于臨床，其與LifePort Liver Transporter、Liver Assist 的比較詳見表1。

本研究的結(jié)果表明，在肝動(dòng)脈恒壓控制模式和門靜脈恒流控制模式下，本設(shè)備能夠在8 h 內(nèi)穩(wěn)定維持壓力和流量水平，說明設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)的穩(wěn)定性良好。同時(shí)，肝動(dòng)脈的流量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而門靜脈壓力表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，說明肝組織在灌注過程中的阻力在降低。Zeng 等[18]使用LifePort Liver Transporter 對(duì)無缺血損傷大鼠肝臟進(jìn)行門靜脈HMP，灌注流量為0.5 mL/[min·g（肝重）]，數(shù)據(jù)表明灌注3 h 內(nèi)能夠顯著降低阻力指數(shù)，隨后穩(wěn)定3 h 灌注阻力穩(wěn)定。李弦等[19]使用LifePort Liver Transporter 探究HMP 對(duì)不同熱缺血時(shí)間下心臟死亡大鼠供肝的灌注效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMP能夠降低熱缺血30 min 肝臟的阻力指數(shù)，但是未能降低熱缺血45 min 肝臟的阻力指數(shù)。本研究使用的DEVOCEAN-LIVER 2000 能夠使熱缺血60 min 肝臟的灌注阻力下降，提示HMP 有助于改善熱缺血損傷嚴(yán)重的肝臟的內(nèi)部通暢程度，有利于移植后肝細(xì)胞獲得充分的血液灌注，表明本設(shè)備的性能比Life Port Liver Transporter 更優(yōu)良。同時(shí)，灌注過程中的pH 值、Lac 水平和Glu 水平基本穩(wěn)定。研究表明，熱缺血損傷會(huì)導(dǎo)致Lac 和Glu 水平升高[20]，故灌注初期的Lac和Glu 水平較高。由于肝臟處于低代謝狀態(tài)，其代謝Lac 和Glu 的能力下降，所以Lac 和Glu 水平維持穩(wěn)定證明設(shè)備能夠使肝臟穩(wěn)定處于低代謝水平。

表1 LifePort Liver Transporter、Liver Assist 與DEVOCEAN-LIVER 2000 的比較

器官經(jīng)歷缺血后，盡管缺血細(xì)胞需要氧氣生存，但是如果進(jìn)行常溫復(fù)流灌注常會(huì)導(dǎo)致再灌注損傷[21-22]。復(fù)流引起的損傷主要由線粒體來源的活性氧造成[23-24]。線粒體活性氧會(huì)導(dǎo)致危險(xiǎn)相關(guān)分子模式的釋放，活化庫(kù)普弗細(xì)胞，最后激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致器官損傷[25-26]。曾承[27]利用大鼠的肝臟進(jìn)行HMP 和冷保存的對(duì)比研究，HMP 較冷保存組可以更為有效地為細(xì)胞供氧，增加ATP 合成，提高超氧化物歧化酶活性，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB-p65 相關(guān)炎性反應(yīng)通路的活性，從而減輕心臟死亡肝臟的缺血再灌注損傷。另一項(xiàng)研究結(jié)果提示攜氧HMP 能夠抑制炎癥小體信號(hào)通路，降低IL-1β 和IL-18 的表達(dá)，同時(shí)控制TNF-α 和IL-6 的分泌，從而減輕肝臟的缺血再灌注損傷[28]。本研究中肝組織的IL-6 和TNF-α 水平穩(wěn)定，未見升高，提示本設(shè)備的攜氧HMP 有助于抑制炎癥反應(yīng)。其他機(jī)制研究表明，氧合HMP 可以維持組織的ATP 水平[7，25，28-29]和抑制脂質(zhì)過氧化[30]。另外，HMP 具有促進(jìn)肝細(xì)胞再生的潛能，研究表明，HMP 能夠提高細(xì)胞增殖抗原Ki67、增生細(xì)胞核抗原以及細(xì)胞周期基因的表達(dá)[31]。而在本研究中，病理學(xué)評(píng)價(jià)表明低溫氧合灌注能夠防止肝細(xì)胞壞死惡化，項(xiàng)目組將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中探究低溫氧合灌注對(duì)肝細(xì)胞再生的影響。器官在離開供體后會(huì)遭受缺血和缺氧，研究表明，空泡化可反映肝組織缺血和缺氧損傷的程度[32-33]。Lee 等[34]發(fā)現(xiàn)攜氧HMP 能夠抑制熱缺血30 min 肝臟的空泡形成，維持肝小葉結(jié)構(gòu)正常。有研究使用LifePort Liver Transporter 對(duì)無缺血損傷大鼠肝臟進(jìn)行門靜脈的HMP，灌注流量為0.5 mL/[min·g（肝重）]，組織學(xué)評(píng)價(jià)表明灌注明顯擴(kuò)張了肝竇，且由于LifePort liver Transporter 設(shè)備屬于非攜氧灌注，肝組織的空泡化水平未出現(xiàn)改善[18]。但在另一項(xiàng)研究中，與靜態(tài)冷保存相比，非攜氧HMP 亦能夠降低肝細(xì)胞的空泡化水平，同時(shí)改善肝竇淤血情況[31]。本研究的結(jié)果提示低溫氧合灌注可降低肝組織的空泡化水平。未來需要更多的實(shí)驗(yàn)來探討HMP 對(duì)肝組織病理學(xué)改變的影響。

綜上所述，離體肝臟雙泵雙氧合機(jī)械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000 在離體豬肝模型中獲得了比較穩(wěn)定的結(jié)果，說明了設(shè)備的安全性和穩(wěn)定性，不僅能維持肝臟的低代謝狀態(tài)，還能降低灌注阻力和改善肝細(xì)胞缺氧。未來項(xiàng)目組將設(shè)計(jì)灌注后肝移植實(shí)驗(yàn)或者模擬復(fù)流實(shí)驗(yàn)，并以靜態(tài)冷保存為對(duì)照組，進(jìn)一步評(píng)價(jià)HMP 系統(tǒng)的安全性和有效性，為其日后的臨床應(yīng)用提供理論支持。