章曉辰 李盈科

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是以肺部炎癥和肺泡毛細(xì)血管屏障破壞為特征的臨床綜合征，常繼發(fā)于重癥肺炎、膿毒癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷等疾病[1]。多種炎癥細(xì)胞參與了ALI肺部炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程。中性粒細(xì)胞在清除肺部病原體的同時破壞了肺泡毛細(xì)血管屏障，甚至促使疾病進(jìn)展為呼吸窘迫綜合征。趨化因子在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的定向聚集過程中發(fā)揮重要作用。趨化因子CXCL15在小鼠黏膜上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)[2]，其與人類IL-8基因同源，在肺部發(fā)生炎癥時對炎癥細(xì)胞的聚集和浸潤起到重要作用[3-4]。

衣康酸由免疫應(yīng)答基因1(immune-responsive gene 1，IRG1)編碼的順烏頭酸脫羧酶與三羧酸循環(huán)中的順烏頭酸發(fā)生脫羧反應(yīng)而來，在活化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞中大量產(chǎn)生并分泌[5-6]。衣康酸可在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮殺菌活性[7-8]，還可以通過影響細(xì)胞因子的表達(dá)和炎癥細(xì)胞的分化發(fā)揮重要的抗炎作用[9-11]，但其是否對上皮細(xì)胞發(fā)揮作用尚不明確。二甲基衣康酸(DMI)和四辛基衣康酸(OI)是兩種膜浸潤性較強(qiáng)的衣康酸衍生物，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可以自由透過細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。 本研究利用小鼠肺上皮細(xì)胞系膿毒癥模型，探索衣康酸對肺上皮細(xì)胞趨化因子的表達(dá)影響，對趨化因子介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤的調(diào)節(jié)作用，以及其在膿毒癥條件下的器官保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物和細(xì)胞株來源與主要試劑 6～8周C57BL/6小鼠，購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0003，使用許可證號SYXK(滬)2012-0003]。小鼠Ⅱ型肺上皮細(xì)胞系MLE-12(CRL-2110)和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(CCL-185)均購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；DMI購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；OI購自美國Cayman Chemical公司；實時定量PCR引物購自上海生工生物科技有限公司；紫草素葉綠素(PerCP)標(biāo)記的抗小鼠CD45抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗小鼠CD11b抗體購自BioLegend公司。多聚甲醛、PBS等常用試劑均由海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究所提供。

1.2 小鼠膿毒癥模型的建立 采用數(shù)字表法將8只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為PBS組和LPS組，每組4只。LPS組小鼠予腹腔內(nèi)注射5 mg/kg LPS，PBS組注射等量PBS。24 h后處死小鼠，收集其肺組織進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 衣康酸衍生物干預(yù)LPS處理的肺上皮細(xì)胞 將MLE-12細(xì)胞培養(yǎng)于含2%的胎牛血清(FBS，購自美國Gibco公司)和1%的青霉素、鏈霉素、兩性霉素溶液(購自美國Thermo Fisher公司)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后換液，將細(xì)胞懸液接種于24孔板中，隨機(jī)分為二甲基亞砜(DMSO)組、低濃度DMI組、高濃度DMI組、低濃度OI組、高濃度OI組，每組4孔。低濃度和高濃度衣康酸組分別加入終濃度為62.5 μmol/L和125 μmol/L的DMI或OI溶液，DMSO組加入等體積DMSO；3 h后，加入LPS(終質(zhì)量濃度為10 mg/L)，刺激6 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，繼續(xù)后續(xù)實驗。將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS(購自美國Gibco公司)和1%的青霉素、鏈霉素、兩性霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基， 置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后換液，將細(xì)胞懸液接種于24孔板中，隨機(jī)分為DMSO組、低濃度DMI組、高濃度DMI組，每組4孔，分別加入DMSO和終濃度為62.5 μmol/L、125 μmol/L DMI預(yù)處理3 h后，加入LPS(終質(zhì)量濃度為10 mg/L)；刺激6 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總mRNA，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 應(yīng)用衣康酸衍生物干預(yù)小鼠肺損傷模型 采用數(shù)字表法將18只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為PBS組、DMI組、OI組，每組6只。 按照50 mg/kg分別計算DMI和OI的用量，用PBS配置成懸液。DMI組、OI組小鼠氣管內(nèi)滴注相應(yīng)的藥物懸液15 μL，PBS組氣管內(nèi)滴注等體積PBS。6 h后，所有小鼠予腹腔內(nèi)注射LPS(5 mg/kg)，飼養(yǎng)24 h。每組隨機(jī)選取3只小鼠提取其支氣管肺泡灌洗液，之后取所有小鼠肺組織，繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.5 肺組織病理學(xué)檢查 右下葉肺組織以4%多聚甲醛固定24 h。制備石蠟切片(厚度為4 μm)，經(jīng)H-E染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。以鏡下肺泡壁寬度評估肺組織水腫情況，通過肺泡壁周圍有核細(xì)胞密度評估炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.6 支氣管肺泡灌洗液的獲取和流式細(xì)胞術(shù)檢測 各組小鼠經(jīng)PBS或衣康酸衍生物預(yù)處理，腹腔內(nèi)注射LPS 24 h后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，手術(shù)暴露氣管，并插管。用2 mL PBS反復(fù)沖洗后吸出，置于eppendort管中；立即于4 ℃ 200×g離心5 min， 獲取的細(xì)胞用1∶50加入熒光抗體的PBS重懸，并避光孵育10 min，再次離心(200 ×g，5 min， 4 ℃)，并以100 μL PBS重懸后，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 利用總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)按照實驗步驟提取各組MLE-12和A549細(xì)胞總RNA，置于-80 ℃保存至使用。對于每個樣本，在20 μL反轉(zhuǎn)錄體系中，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)錄1 000 ng RNA。實時定量PCR反應(yīng)按照TB Green(日本TaKaRa公司)說明書混合轉(zhuǎn)錄模版、引物和試劑，進(jìn)行定量PCR。以GAPDH作為內(nèi)參對照，對比TNF-α、IL-6、CXCL15(或IL-8)mRNA相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型和肺上皮細(xì)胞模型特征 在LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)，LPS組小鼠肺部中性粒細(xì)胞浸潤較PBS組明顯，見圖1。與未處理的MLE-12細(xì)胞(0 h)相比，LPS誘導(dǎo)小鼠MLE-12細(xì)胞3、6 h后，TNF-α、IL-6和CXCL15的mRNA相對表達(dá)量均顯著升高(P值分別<0.01, 0.05)。見表2。

A PBS組 B LPS組圖1 腹腔內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥模型小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤情況(H-E染色，×100)

表2 LPS誘導(dǎo)的各時間點MLE-12細(xì)胞各炎癥因子mRNA相對表達(dá)量的比較

2.2 衣康酸衍生物降低LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)量 低濃度和高濃度DMI組各細(xì)胞炎癥因子mRNA相對表達(dá)量均顯著低于DMSO組(P值均<0.01)。高濃度OI組各細(xì)胞炎癥因子mRNA相對表達(dá)量均顯著低于低濃度OI組和DMSO組(P值分別<0.01，0.05)；低濃度OI組僅IL-6 mRNA相對表達(dá)量顯著低于DMSO組(P<0.01)。見表3。

表3 兩種衣康酸衍生物預(yù)處理后MLE-12細(xì)胞各炎癥因子mRNA相對表達(dá)量的比較

2.3 DMI降低LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)量 低濃度DMI預(yù)處理后，A549細(xì)胞的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA相對表達(dá)量與DMSO組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。高濃度DMI預(yù)處理的A549細(xì)胞的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA相對表達(dá)量均顯著低于低濃度DMI組和DMSO組(P值分別<0.01、0.05)。見表4。

表4 DMI預(yù)處理后A549細(xì)胞各炎癥因子mRNA相對表達(dá)量的比較

2.4 衣康酸衍生物經(jīng)氣管內(nèi)給藥減輕膿毒癥模型小鼠肺損傷 觀察小鼠肺臟大體標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，DMI組和OI組小鼠肺泡內(nèi)出血面積均小于PBS組，見圖2。H-E染色示：DMI和OI組小鼠肺組織肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤水平均低于PBS組，見圖3。

圖2 不同預(yù)處理的膿毒癥模型小鼠肺部損傷情況

各組小鼠的肺泡灌洗液流式細(xì)胞術(shù)檢測示：DMI組和OI組小鼠肺泡灌洗液中CD11b陽性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)分別占總細(xì)胞數(shù)的(41.467±6.850)%和(39.767±9.393)%，均較PBS組的(65.433±5.179)%顯著降低(P值均<0.05)，見圖4。

A PBS組 B DMI組 C OI組圖4 不同預(yù)處理的膿毒癥模型小鼠肺泡灌洗液中CD11b陽性細(xì)胞比例

3 討 論

中性粒細(xì)胞參與肺部炎癥的發(fā)生與發(fā)展，而過度的中性粒細(xì)胞浸潤，可能引起上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的死亡[12]，加重局部組織損傷。趨化因子對炎癥條件下中性粒細(xì)胞的局部定向性聚集有重要影響，尤其是IL-8(小鼠體內(nèi)表達(dá)為CXCL15)在肺黏膜等部位表達(dá)水平較高[2]，在局部炎癥趨化反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。 所以，限制中性粒細(xì)胞的過度聚集，維持適當(dāng)?shù)慕M織炎癥反應(yīng)程度，在控制ALI的發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

經(jīng)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型小鼠肺臟出現(xiàn)了明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。在小鼠MLE-12細(xì)胞系中也觀察到，細(xì)胞系經(jīng)LPS誘導(dǎo)3、6 h后，TNF-α、IL-6和CXCL15 mRNA相對表達(dá)量即明顯升高，說明在膿毒癥的早期，上皮細(xì)胞即可對炎癥細(xì)胞有直接的趨化作用，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集，從而使ALI的發(fā)生成為可能。

衣康酸除可在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)控的作用外，在整個免疫調(diào)節(jié)過程中也發(fā)揮著重要的作用。作為線粒體能量代謝和細(xì)胞免疫功能之間的橋梁[10]，衣康酸可作用于包括Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)[6]、IκBζ-ATF3[7]等通路，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能[8]，發(fā)揮抗炎作用。同時，衣康酸被發(fā)現(xiàn)對體內(nèi)組織有一定的抗氧化作用，衣康酸預(yù)注射可以縮小心肌缺血小鼠模型心肌梗死的面積[8]，提示衣康酸存在潛在的器官保護(hù)作用。IRG1不僅僅在活化狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)；在病毒感染的肺組織、神經(jīng)元，甚至妊娠期的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，IRG1的表達(dá)水平也有提高[13-18]；這些都提示了IRG1和衣康酸不僅表達(dá)于免疫細(xì)胞，同時也在實質(zhì)細(xì)胞的病理生理過程中表達(dá)，并可能發(fā)揮作用。

本研究使用DMI和OI預(yù)處理MLE-12和A549細(xì)胞系，小鼠氣管內(nèi)滴注衣康酸衍生物，以探索衣康酸在ALI中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然LPS可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子和趨化因子mRNA相對表達(dá)量增加，但兩種衣康酸衍生物均對LPS誘導(dǎo)的炎癥有抑制作用；并且，OI在較高濃度下(125 μmol/L)可以降低CXCL15 mRNA的表達(dá)，而DMI在較低濃度下(62.5 μmol/L)即可發(fā)揮炎癥抑制作用。在后續(xù)的小鼠體內(nèi)實驗中，經(jīng)氣管內(nèi)給予DMI或OI的小鼠在LPS誘導(dǎo)后肺出血面積較小、肺上皮毛細(xì)血管屏障破壞較少，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤程度較低。經(jīng)肺泡灌洗液細(xì)胞組成比例分析驗證，經(jīng)DMI或OI處理的小鼠肺泡灌洗液中，中性粒細(xì)胞的比例均較對照組顯著下降。

綜上所述，在肺泡內(nèi)局部應(yīng)用衣康酸衍生物可以減少膿毒癥小鼠肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞的聚集和浸潤，其機(jī)制可能與衣康酸衍生物可以減少肺上皮細(xì)胞在膿毒癥條件下細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)相關(guān)。說明了衣康酸在膿毒癥或全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展過程中具有潛在的器官保護(hù)作用。