田東浩 許文耀 余 輝 楊薇粒 鄭百俊 高 亞 潘偉康

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung"s disease，HSCR）是最常見的先天性胃腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，活產(chǎn)兒中發(fā)病率為1／5 000，男性發(fā)病率約為女性的4 倍，主要臨床表現(xiàn)為病變腸管痙攣、腸內(nèi)容物通過受阻引起下消化道梗阻；病理學(xué)改變?yōu)椴∽兡c管神經(jīng)節(jié)缺如以及神經(jīng)纖維增粗、增多［1-4］。 其發(fā)病機制為胚胎第3 ～12 周時來自迷走神經(jīng)的腸神經(jīng)嵴前體細胞（enteric neural crest cells，ENCCs）沿頭向尾方向遷移障礙所致［5-7］。 研究表明，多基因如SOX10、NRG1、RET、SIP1、GDNF 等參與HSCR 的發(fā)生過程，但其確切發(fā)病機制仍未完全清楚［8］。

MicroRNA （miRNA） 是內(nèi)源性小分子非編碼RNA，大小為19 ～25 bp，以直接結(jié)合靶基因mRNA的3"-非翻譯區(qū)（3"-UTR）阻遏翻譯和（或）誘導(dǎo)mRNA 降解的方式，參與調(diào)控細胞周期、分化、遷徙和凋亡以及能量代謝等多種細胞活動［9-11］。 既往研究表明，HSCR 患者腸組織中存在大量異常表達的miRNA，如miR-206［12，13］、miR-192／215［14］、miR-140-5p［15］和miR-132／212［16］等，它們可能與HSCR 發(fā)生相關(guān)。 研究表明，miR-939 可通過靶向HDGF 誘導(dǎo)WNT／β-Catenin 途徑失活，還可通過靶向IGF-1R 誘導(dǎo)PI3K／Akt 途徑失活，進而調(diào)控癌細胞增殖、遷移和凋亡，發(fā)揮抑癌作用［17，18］。 陳廣林等報道m(xù)iR-939 可靶向LRSAM1 并抑制HSCR 中ENCCs 增殖［19］。 SOX4 為SOX （Sry-related HMG box） 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛參與胚胎期神經(jīng)元發(fā)育、軸突形成、神經(jīng)元映射以及生殖系統(tǒng)發(fā)育等過程。有報道顯示，SOX4 可能通過Notch 信號通路調(diào)控Mash1、Ngn1 和Ngn2 轉(zhuǎn)錄因子表達，并與SOX11 發(fā)揮協(xié)同作用［20］。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SOX4 在HSCR 患者腸組織中低表達［21］。 目前尚不清楚miR-939 對SOX4 的調(diào)控及二者對ENCCs 功能表型的影響，以及miR-939／SOX4 在HSCR 發(fā)病中的機制。

本研究擬通過檢測miR-939 和SOX4 在HSCR患者腸組織中的表達水平，評估m(xù)iR-939 對SOX4表達調(diào)控作用，以及miR-939、SOX4 對ENCCs 增殖、凋亡和遷移的影響，并探討miR-939／SOX4 在HSCR 干預(yù)治療中的潛在價值。

材料與方法

一、主要實驗材料

孕齡15 ～20 d 的Sprague Dawley （SD） 大鼠購自廣州弗爾博生物科技有限公司；DMEM／F12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶、Lipofectamine 2000、Trizol試劑均購自美國Invitrogen 公司；Nestin、GFAP、SOX4 單克隆一抗均購自美國Abcam 公司；miR-939模擬物、SOX4 siRNA 及陰性對照試劑均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；CCK8 試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell 遷移室、增強的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購自美國Millipore 公司；Annexin V-FITC ／ PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Yeasen 公司；TaqMan MicroRNA 檢測試劑盒、ABI 7900HT 熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems 公司；SYBR GREEN 1 購自日本TaKaRa 公司；RIPA 緩沖液購自南京森貝伽生物科技有限公司；PVDF 膜購自美國Thermo Fisher Scientifc 公司。

二、研究方法

1． 患者組織樣本采集 收集2019 年1 月至2020 年1 月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院進行手術(shù)治療的30 例HSCR 患者狹窄段（無神經(jīng)節(jié)細胞腸段）腸組織，另選取30 例經(jīng)手術(shù)治療腸套疊患者的結(jié)腸非病變處組織作為對照；所有組織標(biāo)本用生理鹽水沖洗后保存于-80℃環(huán)境下。 HSCR 患者年齡為30 天至5 歲，男23 例，女7 例。 對照組患者年齡為1 ～5 歲，男20 例，女10 例。 兩組患者基線資料匹配，具有可比性。 本研究開展前獲得患者監(jiān)護人的書面知情同意書，并獲取我院倫理委員會批準。

2． SD 大鼠ENCCs 分離培養(yǎng) 參考肖莉等［22］的研究方法進行ENCCs 分離培養(yǎng)。 取孕15 ～18 天SD 胎鼠腸管，小心剔除腸系膜后充分剪碎，分別用胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶消化30 min、10 min，添加胎牛血清終止消化，無菌濾網(wǎng)過濾，于37℃下1 000 r／min 離心3 min，棄上清后PBS 沖洗3 次，完全培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，按照6 ×105個細胞／mL 的密度接種到培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 ～5 d，然后傳代培養(yǎng)。 傳代5 次后進行克隆球的分化培養(yǎng)，取適量左旋多聚賴氨酸包被蓋玻片于24 孔板中過夜，無菌雙蒸水清洗3 次，600 r／min 離心2 min 離心收集懸浮神經(jīng)球，0． 25% 胰蛋白酶消化5 ～10 min，輕柔吹打，制成單細胞懸液，離心棄上清，添加10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，以每孔1 ×105細胞／mL 接種于24 孔板，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)8 h，觀察克隆球的分化情況。

3． SD 大鼠ENCCs 鑒定 收集懸浮生長狀態(tài)良好的神經(jīng)球離心，用4% 多聚甲醛固定30 min，0．5% Triton X-100 室溫透膜10 min，5%胎牛血清室溫封閉30 min，4℃下將蓋玻片分別于1 ∶500 稀釋的鼠抗Nestin 和兔抗GFAP 一抗中過夜孵育，室溫復(fù)溫1 h，PBS 清洗，然后與FITC 綠色和TRITC 紅色熒光二抗室溫孵育1 h，PBS 清洗，DAPI 染色10 min，將蓋玻片置于熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。

4． ENCCs 轉(zhuǎn)染 收集懸浮生長狀態(tài)良好的神經(jīng)球于離心管中，37℃下1 000 r／min 離心3 min，棄上清，0．25%胰蛋白酶消化5 ～10 min，輕柔吹打，制成單細胞懸液，離心棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸，按照2 ×105細胞／孔的密度接種于6 孔板中。 根據(jù)制造商說明書，配合使用Lipofectamine 2 000 將miR-939 模擬物、SOX4-siRNA 和陰性對照試劑轉(zhuǎn)染細胞。

5． ENCCs 增殖測定 分別用miRNA 或siRNA轉(zhuǎn)染48 h 后，使用CCK-8 細胞活力檢測試劑盒測定細胞活力以評估增殖情況，使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度，記錄OD 值。

6． ENCCs 凋亡測定 將miRNA 或siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞于37℃、5%CO2條件下孵育48 h 后進行收集，根據(jù)制造商說明書，使用Annexin V-FITC ／ PI 細胞凋亡檢測試劑盒進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

7． ENCCs 遷移測定 使用孔徑8 μm 規(guī)格的Transwell 遷移小室進行細胞遷移分析，將轉(zhuǎn)染的細胞置于完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密度為1 ×105細胞／ml，并添加100 μL 到上室中，將600 μL 含有10%FBS 的分化培養(yǎng)基添加到下室中，于37℃、5%CO2條件下孵育24 h 后，用棉簽小心擦拭上室，預(yù)冷PBS 清洗后，乙醇固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 充分清洗后，在顯微鏡下（ ×100）隨機選擇5個視野留取照片進行計數(shù)。

8． RNA 分離和qRT-PCR 按照試劑商說明書上方法使用Trizol 試劑從組織樣品和細胞中提取總RNA 用于后續(xù)實驗。 TaqMan MicroRNA 檢測試劑盒用于檢測miR-939，以U6 作為標(biāo)準化對照。通過ABI 7900HT 熒光定量PCR 儀和SYBR GREEN 1 檢測SOX4 mRNA 表達水平，以GAPDH 作為內(nèi)參。 實驗用到的引物序列如下：SOX4，正向，5"-CGAGAAAATCGGGTAGCCCA-3"， 反 向，5"-CAGATTCACTCGCAATGCCC-3"； GAPDH， 正 向 5"-GTGGAATGGTGCAGACCAAG-3"， 反 向 5"-GTCAGGAGGTGGGATGTTGG-3"。 全部實驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct 法評估m(xù)iRNA 或mRNA 的表達水平。

9． Western blot 按照試劑商說明書方法，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液從組織和細胞中提取總蛋白質(zhì)。 采用Bradford 方法檢測蛋白質(zhì)濃度。 采用15%SDS-PAGE 分離出等量蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉，分別以1 ∶500和1 ∶1 000 的稀釋度與抗SOX4 和抗GAPDH 一抗孵育，4℃條件下過夜，在室溫（37℃）條件下與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗共孵育1 h，使用增強的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進行顯影，GAPDH 作為內(nèi)部對照。 使用ImageJ 軟件對條帶進行定量分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS24．0 進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果中服從正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以（±s）表示，所有實驗獨立重復(fù)3 次以上。 采用獨立樣本t 檢驗進行兩組間差異性分析，采用單因素方差分析及基于Bonferroni校正的事后多重檢驗進行多組間差異比較，P ＜0．05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ENCCs 神經(jīng)球鑒定

于原代培養(yǎng)第3 天、第5 天在光學(xué)顯微鏡下觀察ENCCs 來源神經(jīng)球生長情況，通過Nestin 和GFAP 雙免疫熒光染色對ENCCs 來源的神經(jīng)球進行鑒定，結(jié)果可見神經(jīng)球表現(xiàn)為Nestin（紅色熒光）和GFAP（綠色熒光）雙陽性，細胞核被DAPI 染為藍色，Nestin+ ／GFAP+雙陽性表示細胞為ENCC 細胞（圖1）。

二、HSCR 患者腸組織中miR-939 和SOX4 表達

分別通過RT-PCR 檢測HSCR 患者腸組織中miR-939 和SOX4 mRNA 的表達水平，通過Western blot 檢測SOX4 蛋白表達水平。 結(jié)果表明，與腸套疊患者腸組織相比，HSCR 患者腸組織中miR-939 的表達水平顯著增加（圖2A），SOX4 的mRNA（圖2B）和蛋白（圖2C，圖2D）表達水平顯著降低。

圖1 ENCCs 來源神經(jīng)球光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果和免疫熒光染色結(jié)果（ ×200） A：原代培養(yǎng)第3 天的神經(jīng)球； B：原代培養(yǎng)第5天的神經(jīng)球； C：GFAP 陽性（綠色區(qū)域）； D：Nestin 陽性（紅色區(qū)域）； E：DAPI 陽性（藍色區(qū)域）； F：染色融合Fig．1 Observation of light microscopy and Nestin／GFAP immunofluorescence staining of ENCCs neurosphere （ ×200）

圖2 先天性巨結(jié)腸患者（HSCR 組）和腸套疊患者（control 組）腸組織中miR-939 和SOX4 的表達情況 A、B：RT-PCR 檢測miR-939（A）和SOX4 mRNA（B）表達； C：Western blot 檢測SOX4 蛋白表達； D：Western blot 條帶ImageJ 定量結(jié)果； *代表與control 組比較，P ＜0．05Fig．2 miR-939／SOX4 expression in intestinal tissues of patients with Hirschsprung"s disease and intussusception

圖3 上調(diào)miR-939 的表達對腸神經(jīng)嵴干細胞增殖、凋亡和遷移的影響 A：轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 上調(diào)細胞中miR-939 的表達；B：CCK8 法測定細胞增殖； C，D：Annexin V-FITC／PI 法測定細胞凋亡； E，F(xiàn)：Transwell 實驗檢測細胞遷移； *代表與對照比較，P ＜0．05Fig．3 Effect of up-regulated miR-939 expression on the proliferation，apoptosis and migration of enteric neural crest stem cells

圖4 ENCCs 中miR-939 靶向調(diào)控SOX4 表達 A：RT-PCR 檢測SOX4 mRNA 表達； B：Western blot 檢測SOX4 蛋白表達； C：Western blot 條帶ImageJ 定量結(jié)果； D：通過miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-939 靶基因； *表示與對照比較，P ＜0．05Fig．4 Up-regulated miR-939 regulated SOX4 expression in enteric neural crest stem cells

圖5 下調(diào)SOX4 的表達對腸神經(jīng)嵴干細胞增殖、凋亡和遷移的影響 A、B：RT-PCR 和Western blot 證實轉(zhuǎn)染SOX4-siRNA 可敲低ENCCs 細胞中SOX4 的mRNA 和蛋白表達； C：CCK8 法測定細胞增殖； D：Annexin V-FITC ／ PI 法測定細胞凋亡； E：Transwell 實驗檢測細胞遷移； *代表與對照比較，P ＜0．05Fig．5 Effect of down-regulation of SOX4 expression on proliferation，apoptosis and migration of enteric neural crest stem cells

三、miR-939 表達上調(diào)對ENCCs 增殖、凋亡和遷移能力的影響

使用miR-939 mimic 轉(zhuǎn)染ENCCs，RT-PCR 檢測結(jié)果顯示miR-939 的表達水平上調(diào)（圖3A）。 CCK-8 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，上調(diào)miR-939 的表達顯著抑制ENCCs 細胞增殖（圖3B）；流式細胞儀分析表明，與對照組相比，上調(diào)miR-939 的表達顯著促進ENCCs 細胞凋亡（圖3C，圖3D）；Transwell 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，上調(diào)miR-939 的表達顯著抑制ENCCs 細胞遷移（圖3E，圖3F）。

四、miR-939 靶向調(diào)控ENCCs SOX4 表達水平

轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 后，分別通過RT-PCR 和Western blot 檢測SOX4 的mRNA 和蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 顯著抑制ENCCs 細胞中SOX4 的表達（圖4A—圖4C）。在miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測到miR-939 靶基因數(shù)分別為2 059 個、72 個和1 294 個，三個數(shù)據(jù)預(yù)測到的共同靶基因有8 個，其中包含SOX4，在TargetScan 獲得miR-939 與SOX4結(jié)合位點信息（圖4D）。

五、下調(diào)SOX4 對ENCCs 增殖、凋亡和遷移能力的影響

使用SOX4-siRNA 轉(zhuǎn)染ENCCs 細胞，RT-PCR和Western blot 檢測結(jié)果顯示SOX4 的mRNA 和蛋白表達下調(diào)（圖5A，圖5B），分別檢測ENCCs 細胞增殖、遷移和凋亡（方法同前），結(jié)果表明，下調(diào)SOX4 的表達可顯著抑制ENCCs 細胞的增殖（圖5C）和遷移（圖5E），并促進凋亡（圖5D）。

討 論

腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）屬于直接調(diào)節(jié)胃腸系統(tǒng)的獨立神經(jīng)系統(tǒng)，而腸神經(jīng)嵴前體細胞（enteric neural crest cells，ENCCs）發(fā)育障礙是導(dǎo)致ENS 相關(guān)疾病，引發(fā)腸道功能異常的主要原因之一［23］。 當(dāng)ENCCs 增殖、凋亡、遷移和分化等過程出現(xiàn)異常時可引起先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung"s disease，HSCR）［24］。 HSCR 的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，涉及多個基因轉(zhuǎn)錄和表達異常，盡管很多學(xué)者已經(jīng)鑒定出一些導(dǎo)致HSCR 發(fā)生的關(guān)鍵基因，但尚不清楚導(dǎo)致其發(fā)病機理的主要機制。

在胚胎發(fā)生過程中，ENCCs 從結(jié)腸前端到遠端的遷移需要持續(xù)數(shù)周，此過程中影響ENCCs 增殖、遷移和凋亡的各種因素均可能影響神經(jīng)節(jié)的形成。大量研究已證明miRNA 在胚胎發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，而關(guān)于miRNA 參與HSCR 的發(fā)病過程也有較多研究。 據(jù)報道，miR-192／215 在HSCR組織樣品中顯著下調(diào)，且沉默miR-192／215 通過靶向Nidogen 1（NID1）抑制人293T 和SH-SY5Y 細胞的增殖和遷移［14］。 另外，miR-206 的下調(diào)通過抑制細胞增殖和遷移而參與HSCR 的發(fā)生［12，13］。 下調(diào)miR-200a／141 通過調(diào)節(jié)磷酸酶-張力蛋白同源物的表達在HSCR 發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用［25］。 此外，有學(xué)者研究報道，HSCR 患者血漿外泌體中存在異常高表達的miRNAs 分子，有可能參與細胞外基質(zhì)-受體相互作用，通過干擾細胞連接而促進HSCR 發(fā)生［26］。 本研究發(fā)現(xiàn)miR-939 在HSCR 患者結(jié)腸組織樣本中顯著上調(diào)，并且上調(diào)miR-939 的表達顯著抑制ENCCs 的遷移和增殖，并促進細胞凋亡。 這些結(jié)果表明miR-939 的異常高表達可能直接參與破壞ENCCs 功能的過程，從而促進先天性巨結(jié)腸的發(fā)展。

性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率族盒蛋白4（Sry-related HMG box 4，SOX4）為SOX（Sry-related HMG box）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛參與胚胎期神經(jīng)元發(fā)育、軸突形成和神經(jīng)元映射，以及生殖系統(tǒng)發(fā)育等過程，并在多種類型的人類惡性腫瘤患者組織中呈高表達狀態(tài)。 SOX4 的高表達與腫瘤血管生成以及對放化療的抗性有關(guān)［27］。 據(jù)報道，SOX4 的上調(diào)促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲，SOX4 的高表達可抑制宮頸癌細胞對化療藥物的敏感性。 SOX4可能通過Notch 信號通路調(diào)控Mash1、Ngn1 和Ngn2轉(zhuǎn)錄因子表達，并與SOX11 發(fā)揮協(xié)同作用調(diào)控神經(jīng)發(fā)生［20］。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，先天性巨結(jié)腸組織樣本中SOX4 表達顯著下調(diào)［21］，提示SOX4 可能參與HSCR 的發(fā)病過程。 基于此，本研究通過轉(zhuǎn)染靶向SOX4 的siRNA 敲低ENCCs 細胞中SOX4 的表達，結(jié)果顯示，下調(diào)SOX4 可顯著抑制ENCCs 細胞增殖和遷移能力，促進細胞凋亡。 本研究還觀察到上調(diào)miR-939 可顯著抑制ENCCs 細胞中SOX4 的表達，并獲得與敲低SOX4 類似ENCCs 表型變化結(jié)果。 此外，通過miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測到miR-939 可能的靶基因為SOX4，在TargetScan 獲得miR-939 與SOX4 結(jié)合位點信息。以上結(jié)果表明，miR-939 可能通過靶向調(diào)控SOX4 表達來影響ENCCs 細胞功能，進而參與HSCR 發(fā)生過程。

HSCR 的早期診斷和治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。 然而，臨床上HSCR 具有多種亞型及復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，鋇灌腸、直腸肛門測壓、家族史和基因診斷技術(shù)等均不能對HSCR 進行可靠預(yù)測，主要依賴于直腸活組織檢查發(fā)現(xiàn)特征性神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量的減少來做出最終診斷。 有學(xué)者［26］提到循環(huán)生物標(biāo)志物對HSCR 的診斷意義，肝癌和結(jié)腸癌患者血液中miR-939 表達水平均對疾病診斷和預(yù)后具有獨立預(yù)測價值，并對促炎基因表達有調(diào)控作用。 因此，有必要開展針對HSCR 患者血液循環(huán)miRNAs 的研究，為臨床上通過檢測血液循環(huán)miR-939 作為HSCR 診斷的輔助手段提供證據(jù)支持。

綜上所述，本研究認為，miR-939 和SOX4 均參與HSCR 的發(fā)病過程。 HSCR 患者腸組織中miR-939 顯著上調(diào)，而SOX4 顯著下調(diào)。 上調(diào)miR-939 或下調(diào)SOX4 均可抑制ENCCs 的增殖和遷移，并誘導(dǎo)細胞凋亡。 miR-939 的高表達通過靶向抑制SOX4表達，從而抑制ENCCs 的生長、遷移和促進凋亡，從而參與HSCR 的發(fā)生發(fā)展過程。 因此，靶向miR-939 或SOX4 的干預(yù)措施可能是HSCR 臨床診斷與治療的新思路。