亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        先天性巨結(jié)腸中miR-939 靶向調(diào)控SOX4 表達抑制腸神經(jīng)嵴前體細胞功能表型的實驗研究

        2021-04-02 01:06:54田東浩許文耀楊薇粒鄭百俊潘偉康
        臨床小兒外科雜志 2021年3期
        關鍵詞:結(jié)腸靶向調(diào)控

        田東浩 許文耀 余 輝 楊薇粒 鄭百俊 高 亞 潘偉康

        先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung"s disease,HSCR)是最常見的先天性胃腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一,活產(chǎn)兒中發(fā)病率為1/5 000,男性發(fā)病率約為女性的4 倍,主要臨床表現(xiàn)為病變腸管痙攣、腸內(nèi)容物通過受阻引起下消化道梗阻;病理學改變?yōu)椴∽兡c管神經(jīng)節(jié)缺如以及神經(jīng)纖維增粗、增多[1-4]。 其發(fā)病機制為胚胎第3 ~12 周時來自迷走神經(jīng)的腸神經(jīng)嵴前體細胞(enteric neural crest cells,ENCCs)沿頭向尾方向遷移障礙所致[5-7]。 研究表明,多基因如SOX10、NRG1、RET、SIP1、GDNF 等參與HSCR 的發(fā)生過程,但其確切發(fā)病機制仍未完全清楚[8]。

        MicroRNA (miRNA) 是內(nèi)源性小分子非編碼RNA,大小為19 ~25 bp,以直接結(jié)合靶基因mRNA的3"-非翻譯區(qū)(3"-UTR)阻遏翻譯和(或)誘導mRNA 降解的方式,參與調(diào)控細胞周期、分化、遷徙和凋亡以及能量代謝等多種細胞活動[9-11]。 既往研究表明,HSCR 患者腸組織中存在大量異常表達的miRNA,如miR-206[12,13]、miR-192/215[14]、miR-140-5p[15]和miR-132/212[16]等,它們可能與HSCR 發(fā)生相關。 研究表明,miR-939 可通過靶向HDGF 誘導WNT/β-Catenin 途徑失活,還可通過靶向IGF-1R 誘導PI3K/Akt 途徑失活,進而調(diào)控癌細胞增殖、遷移和凋亡,發(fā)揮抑癌作用[17,18]。 陳廣林等報道m(xù)iR-939 可靶向LRSAM1 并抑制HSCR 中ENCCs 增殖[19]。 SOX4 為SOX (Sry-related HMG box) 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,廣泛參與胚胎期神經(jīng)元發(fā)育、軸突形成、神經(jīng)元映射以及生殖系統(tǒng)發(fā)育等過程。有報道顯示,SOX4 可能通過Notch 信號通路調(diào)控Mash1、Ngn1 和Ngn2 轉(zhuǎn)錄因子表達,并與SOX11 發(fā)揮協(xié)同作用[20]。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SOX4 在HSCR 患者腸組織中低表達[21]。 目前尚不清楚miR-939 對SOX4 的調(diào)控及二者對ENCCs 功能表型的影響,以及miR-939/SOX4 在HSCR 發(fā)病中的機制。

        本研究擬通過檢測miR-939 和SOX4 在HSCR患者腸組織中的表達水平,評估m(xù)iR-939 對SOX4表達調(diào)控作用,以及miR-939、SOX4 對ENCCs 增殖、凋亡和遷移的影響,并探討miR-939/SOX4 在HSCR 干預治療中的潛在價值。

        材料與方法

        一、主要實驗材料

        孕齡15 ~20 d 的Sprague Dawley (SD) 大鼠購自廣州弗爾博生物科技有限公司;DMEM/F12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶、Lipofectamine 2000、Trizol試劑均購自美國Invitrogen 公司;Nestin、GFAP、SOX4 單克隆一抗均購自美國Abcam 公司;miR-939模擬物、SOX4 siRNA 及陰性對照試劑均購自上海吉瑪制藥技術有限公司;CCK8 試劑盒購自碧云天生物技術研究所;Transwell 遷移室、增強的化學發(fā)光系統(tǒng)購自美國Millipore 公司;Annexin V-FITC / PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Yeasen 公司;TaqMan MicroRNA 檢測試劑盒、ABI 7900HT 熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems 公司;SYBR GREEN 1 購自日本TaKaRa 公司;RIPA 緩沖液購自南京森貝伽生物科技有限公司;PVDF 膜購自美國Thermo Fisher Scientifc 公司。

        二、研究方法

        1. 患者組織樣本采集 收集2019 年1 月至2020 年1 月在西安交通大學第二附屬醫(yī)院進行手術治療的30 例HSCR 患者狹窄段(無神經(jīng)節(jié)細胞腸段)腸組織,另選取30 例經(jīng)手術治療腸套疊患者的結(jié)腸非病變處組織作為對照;所有組織標本用生理鹽水沖洗后保存于-80℃環(huán)境下。 HSCR 患者年齡為30 天至5 歲,男23 例,女7 例。 對照組患者年齡為1 ~5 歲,男20 例,女10 例。 兩組患者基線資料匹配,具有可比性。 本研究開展前獲得患者監(jiān)護人的書面知情同意書,并獲取我院倫理委員會批準。

        2. SD 大鼠ENCCs 分離培養(yǎng) 參考肖莉等[22]的研究方法進行ENCCs 分離培養(yǎng)。 取孕15 ~18 天SD 胎鼠腸管,小心剔除腸系膜后充分剪碎,分別用胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶消化30 min、10 min,添加胎牛血清終止消化,無菌濾網(wǎng)過濾,于37℃下1 000 r/min 離心3 min,棄上清后PBS 沖洗3 次,完全培養(yǎng)基重懸并計數(shù),按照6 ×105個細胞/mL 的密度接種到培養(yǎng)瓶中,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 ~5 d,然后傳代培養(yǎng)。 傳代5 次后進行克隆球的分化培養(yǎng),取適量左旋多聚賴氨酸包被蓋玻片于24 孔板中過夜,無菌雙蒸水清洗3 次,600 r/min 離心2 min 離心收集懸浮神經(jīng)球,0. 25% 胰蛋白酶消化5 ~10 min,輕柔吹打,制成單細胞懸液,離心棄上清,添加10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸,以每孔1 ×105細胞/mL 接種于24 孔板,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)8 h,觀察克隆球的分化情況。

        3. SD 大鼠ENCCs 鑒定 收集懸浮生長狀態(tài)良好的神經(jīng)球離心,用4% 多聚甲醛固定30 min,0.5% Triton X-100 室溫透膜10 min,5%胎牛血清室溫封閉30 min,4℃下將蓋玻片分別于1 ∶500 稀釋的鼠抗Nestin 和兔抗GFAP 一抗中過夜孵育,室溫復溫1 h,PBS 清洗,然后與FITC 綠色和TRITC 紅色熒光二抗室溫孵育1 h,PBS 清洗,DAPI 染色10 min,將蓋玻片置于熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。

        4. ENCCs 轉(zhuǎn)染 收集懸浮生長狀態(tài)良好的神經(jīng)球于離心管中,37℃下1 000 r/min 離心3 min,棄上清,0.25%胰蛋白酶消化5 ~10 min,輕柔吹打,制成單細胞懸液,離心棄上清,用完全培養(yǎng)基重懸,按照2 ×105細胞/孔的密度接種于6 孔板中。 根據(jù)制造商說明書,配合使用Lipofectamine 2 000 將miR-939 模擬物、SOX4-siRNA 和陰性對照試劑轉(zhuǎn)染細胞。

        5. ENCCs 增殖測定 分別用miRNA 或siRNA轉(zhuǎn)染48 h 后,使用CCK-8 細胞活力檢測試劑盒測定細胞活力以評估增殖情況,使用酶標儀測量450 nm處的吸光度,記錄OD 值。

        6. ENCCs 凋亡測定 將miRNA 或siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞于37℃、5%CO2條件下孵育48 h 后進行收集,根據(jù)制造商說明書,使用Annexin V-FITC / PI 細胞凋亡檢測試劑盒進行染色,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

        7. ENCCs 遷移測定 使用孔徑8 μm 規(guī)格的Transwell 遷移小室進行細胞遷移分析,將轉(zhuǎn)染的細胞置于完全培養(yǎng)基重懸,調(diào)整密度為1 ×105細胞/ml,并添加100 μL 到上室中,將600 μL 含有10%FBS 的分化培養(yǎng)基添加到下室中,于37℃、5%CO2條件下孵育24 h 后,用棉簽小心擦拭上室,預冷PBS 清洗后,乙醇固定10 min,結(jié)晶紫染色10 min,PBS 充分清洗后,在顯微鏡下( ×100)隨機選擇5個視野留取照片進行計數(shù)。

        8. RNA 分離和qRT-PCR 按照試劑商說明書上方法使用Trizol 試劑從組織樣品和細胞中提取總RNA 用于后續(xù)實驗。 TaqMan MicroRNA 檢測試劑盒用于檢測miR-939,以U6 作為標準化對照。通過ABI 7900HT 熒光定量PCR 儀和SYBR GREEN 1 檢測SOX4 mRNA 表達水平,以GAPDH 作為內(nèi)參。 實驗用到的引物序列如下:SOX4,正向,5"-CGAGAAAATCGGGTAGCCCA-3", 反 向,5"-CAGATTCACTCGCAATGCCC-3"; GAPDH, 正 向 5"-GTGGAATGGTGCAGACCAAG-3", 反 向 5"-GTCAGGAGGTGGGATGTTGG-3"。 全部實驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct 法評估m(xù)iRNA 或mRNA 的表達水平。

        9. Western blot 按照試劑商說明書方法,使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液從組織和細胞中提取總蛋白質(zhì)。 采用Bradford 方法檢測蛋白質(zhì)濃度。 采用15%SDS-PAGE 分離出等量蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,用5%脫脂牛奶封閉,分別以1 ∶500和1 ∶1 000 的稀釋度與抗SOX4 和抗GAPDH 一抗孵育,4℃條件下過夜,在室溫(37℃)條件下與辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 二抗共孵育1 h,使用增強的化學發(fā)光系統(tǒng)進行顯影,GAPDH 作為內(nèi)部對照。 使用ImageJ 軟件對條帶進行定量分析。

        三、統(tǒng)計學處理

        使用SPSS24.0 進行統(tǒng)計分析,實驗結(jié)果中服從正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以(±s)表示,所有實驗獨立重復3 次以上。 采用獨立樣本t 檢驗進行兩組間差異性分析,采用單因素方差分析及基于Bonferroni校正的事后多重檢驗進行多組間差異比較,P <0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        一、ENCCs 神經(jīng)球鑒定

        于原代培養(yǎng)第3 天、第5 天在光學顯微鏡下觀察ENCCs 來源神經(jīng)球生長情況,通過Nestin 和GFAP 雙免疫熒光染色對ENCCs 來源的神經(jīng)球進行鑒定,結(jié)果可見神經(jīng)球表現(xiàn)為Nestin(紅色熒光)和GFAP(綠色熒光)雙陽性,細胞核被DAPI 染為藍色,Nestin+ /GFAP+雙陽性表示細胞為ENCC 細胞(圖1)。

        二、HSCR 患者腸組織中miR-939 和SOX4 表達

        分別通過RT-PCR 檢測HSCR 患者腸組織中miR-939 和SOX4 mRNA 的表達水平,通過Western blot 檢測SOX4 蛋白表達水平。 結(jié)果表明,與腸套疊患者腸組織相比,HSCR 患者腸組織中miR-939 的表達水平顯著增加(圖2A),SOX4 的mRNA(圖2B)和蛋白(圖2C,圖2D)表達水平顯著降低。

        圖1 ENCCs 來源神經(jīng)球光學顯微鏡觀察結(jié)果和免疫熒光染色結(jié)果( ×200) A:原代培養(yǎng)第3 天的神經(jīng)球; B:原代培養(yǎng)第5天的神經(jīng)球; C:GFAP 陽性(綠色區(qū)域); D:Nestin 陽性(紅色區(qū)域); E:DAPI 陽性(藍色區(qū)域); F:染色融合Fig.1 Observation of light microscopy and Nestin/GFAP immunofluorescence staining of ENCCs neurosphere ( ×200)

        圖2 先天性巨結(jié)腸患者(HSCR 組)和腸套疊患者(control 組)腸組織中miR-939 和SOX4 的表達情況 A、B:RT-PCR 檢測miR-939(A)和SOX4 mRNA(B)表達; C:Western blot 檢測SOX4 蛋白表達; D:Western blot 條帶ImageJ 定量結(jié)果; *代表與control 組比較,P <0.05Fig.2 miR-939/SOX4 expression in intestinal tissues of patients with Hirschsprung"s disease and intussusception

        圖3 上調(diào)miR-939 的表達對腸神經(jīng)嵴干細胞增殖、凋亡和遷移的影響 A:轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 上調(diào)細胞中miR-939 的表達;B:CCK8 法測定細胞增殖; C,D:Annexin V-FITC/PI 法測定細胞凋亡; E,F(xiàn):Transwell 實驗檢測細胞遷移; *代表與對照比較,P <0.05Fig.3 Effect of up-regulated miR-939 expression on the proliferation,apoptosis and migration of enteric neural crest stem cells

        圖4 ENCCs 中miR-939 靶向調(diào)控SOX4 表達 A:RT-PCR 檢測SOX4 mRNA 表達; B:Western blot 檢測SOX4 蛋白表達; C:Western blot 條帶ImageJ 定量結(jié)果; D:通過miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測到miR-939 靶基因; *表示與對照比較,P <0.05Fig.4 Up-regulated miR-939 regulated SOX4 expression in enteric neural crest stem cells

        圖5 下調(diào)SOX4 的表達對腸神經(jīng)嵴干細胞增殖、凋亡和遷移的影響 A、B:RT-PCR 和Western blot 證實轉(zhuǎn)染SOX4-siRNA 可敲低ENCCs 細胞中SOX4 的mRNA 和蛋白表達; C:CCK8 法測定細胞增殖; D:Annexin V-FITC / PI 法測定細胞凋亡; E:Transwell 實驗檢測細胞遷移; *代表與對照比較,P <0.05Fig.5 Effect of down-regulation of SOX4 expression on proliferation,apoptosis and migration of enteric neural crest stem cells

        三、miR-939 表達上調(diào)對ENCCs 增殖、凋亡和遷移能力的影響

        使用miR-939 mimic 轉(zhuǎn)染ENCCs,RT-PCR 檢測結(jié)果顯示miR-939 的表達水平上調(diào)(圖3A)。 CCK-8 實驗結(jié)果表明,與對照組相比,上調(diào)miR-939 的表達顯著抑制ENCCs 細胞增殖(圖3B);流式細胞儀分析表明,與對照組相比,上調(diào)miR-939 的表達顯著促進ENCCs 細胞凋亡(圖3C,圖3D);Transwell 實驗結(jié)果表明,與對照組相比,上調(diào)miR-939 的表達顯著抑制ENCCs 細胞遷移(圖3E,圖3F)。

        四、miR-939 靶向調(diào)控ENCCs SOX4 表達水平

        轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 后,分別通過RT-PCR 和Western blot 檢測SOX4 的mRNA 和蛋白表達水平,結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 顯著抑制ENCCs 細胞中SOX4 的表達(圖4A—圖4C)。在miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫分別預測到miR-939 靶基因數(shù)分別為2 059 個、72 個和1 294 個,三個數(shù)據(jù)預測到的共同靶基因有8 個,其中包含SOX4,在TargetScan 獲得miR-939 與SOX4結(jié)合位點信息(圖4D)。

        五、下調(diào)SOX4 對ENCCs 增殖、凋亡和遷移能力的影響

        使用SOX4-siRNA 轉(zhuǎn)染ENCCs 細胞,RT-PCR和Western blot 檢測結(jié)果顯示SOX4 的mRNA 和蛋白表達下調(diào)(圖5A,圖5B),分別檢測ENCCs 細胞增殖、遷移和凋亡(方法同前),結(jié)果表明,下調(diào)SOX4 的表達可顯著抑制ENCCs 細胞的增殖(圖5C)和遷移(圖5E),并促進凋亡(圖5D)。

        討 論

        腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)屬于直接調(diào)節(jié)胃腸系統(tǒng)的獨立神經(jīng)系統(tǒng),而腸神經(jīng)嵴前體細胞(enteric neural crest cells,ENCCs)發(fā)育障礙是導致ENS 相關疾病,引發(fā)腸道功能異常的主要原因之一[23]。 當ENCCs 增殖、凋亡、遷移和分化等過程出現(xiàn)異常時可引起先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung"s disease,HSCR)[24]。 HSCR 的發(fā)生是一個復雜的過程,涉及多個基因轉(zhuǎn)錄和表達異常,盡管很多學者已經(jīng)鑒定出一些導致HSCR 發(fā)生的關鍵基因,但尚不清楚導致其發(fā)病機理的主要機制。

        在胚胎發(fā)生過程中,ENCCs 從結(jié)腸前端到遠端的遷移需要持續(xù)數(shù)周,此過程中影響ENCCs 增殖、遷移和凋亡的各種因素均可能影響神經(jīng)節(jié)的形成。大量研究已證明miRNA 在胚胎發(fā)育過程中起著至關重要的作用,而關于miRNA 參與HSCR 的發(fā)病過程也有較多研究。 據(jù)報道,miR-192/215 在HSCR組織樣品中顯著下調(diào),且沉默miR-192/215 通過靶向Nidogen 1(NID1)抑制人293T 和SH-SY5Y 細胞的增殖和遷移[14]。 另外,miR-206 的下調(diào)通過抑制細胞增殖和遷移而參與HSCR 的發(fā)生[12,13]。 下調(diào)miR-200a/141 通過調(diào)節(jié)磷酸酶-張力蛋白同源物的表達在HSCR 發(fā)病過程中起關鍵作用[25]。 此外,有學者研究報道,HSCR 患者血漿外泌體中存在異常高表達的miRNAs 分子,有可能參與細胞外基質(zhì)-受體相互作用,通過干擾細胞連接而促進HSCR 發(fā)生[26]。 本研究發(fā)現(xiàn)miR-939 在HSCR 患者結(jié)腸組織樣本中顯著上調(diào),并且上調(diào)miR-939 的表達顯著抑制ENCCs 的遷移和增殖,并促進細胞凋亡。 這些結(jié)果表明miR-939 的異常高表達可能直接參與破壞ENCCs 功能的過程,從而促進先天性巨結(jié)腸的發(fā)展。

        性別決定區(qū)相關高遷移率族盒蛋白4(Sry-related HMG box 4,SOX4)為SOX(Sry-related HMG box)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,廣泛參與胚胎期神經(jīng)元發(fā)育、軸突形成和神經(jīng)元映射,以及生殖系統(tǒng)發(fā)育等過程,并在多種類型的人類惡性腫瘤患者組織中呈高表達狀態(tài)。 SOX4 的高表達與腫瘤血管生成以及對放化療的抗性有關[27]。 據(jù)報道,SOX4 的上調(diào)促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲,SOX4 的高表達可抑制宮頸癌細胞對化療藥物的敏感性。 SOX4可能通過Notch 信號通路調(diào)控Mash1、Ngn1 和Ngn2轉(zhuǎn)錄因子表達,并與SOX11 發(fā)揮協(xié)同作用調(diào)控神經(jīng)發(fā)生[20]。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn),先天性巨結(jié)腸組織樣本中SOX4 表達顯著下調(diào)[21],提示SOX4 可能參與HSCR 的發(fā)病過程。 基于此,本研究通過轉(zhuǎn)染靶向SOX4 的siRNA 敲低ENCCs 細胞中SOX4 的表達,結(jié)果顯示,下調(diào)SOX4 可顯著抑制ENCCs 細胞增殖和遷移能力,促進細胞凋亡。 本研究還觀察到上調(diào)miR-939 可顯著抑制ENCCs 細胞中SOX4 的表達,并獲得與敲低SOX4 類似ENCCs 表型變化結(jié)果。 此外,通過miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫分別預測到miR-939 可能的靶基因為SOX4,在TargetScan 獲得miR-939 與SOX4 結(jié)合位點信息。以上結(jié)果表明,miR-939 可能通過靶向調(diào)控SOX4 表達來影響ENCCs 細胞功能,進而參與HSCR 發(fā)生過程。

        HSCR 的早期診斷和治療是改善患者預后的關鍵。 然而,臨床上HSCR 具有多種亞型及復雜的臨床表現(xiàn),鋇灌腸、直腸肛門測壓、家族史和基因診斷技術等均不能對HSCR 進行可靠預測,主要依賴于直腸活組織檢查發(fā)現(xiàn)特征性神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量的減少來做出最終診斷。 有學者[26]提到循環(huán)生物標志物對HSCR 的診斷意義,肝癌和結(jié)腸癌患者血液中miR-939 表達水平均對疾病診斷和預后具有獨立預測價值,并對促炎基因表達有調(diào)控作用。 因此,有必要開展針對HSCR 患者血液循環(huán)miRNAs 的研究,為臨床上通過檢測血液循環(huán)miR-939 作為HSCR 診斷的輔助手段提供證據(jù)支持。

        綜上所述,本研究認為,miR-939 和SOX4 均參與HSCR 的發(fā)病過程。 HSCR 患者腸組織中miR-939 顯著上調(diào),而SOX4 顯著下調(diào)。 上調(diào)miR-939 或下調(diào)SOX4 均可抑制ENCCs 的增殖和遷移,并誘導細胞凋亡。 miR-939 的高表達通過靶向抑制SOX4表達,從而抑制ENCCs 的生長、遷移和促進凋亡,從而參與HSCR 的發(fā)生發(fā)展過程。 因此,靶向miR-939 或SOX4 的干預措施可能是HSCR 臨床診斷與治療的新思路。

        猜你喜歡
        結(jié)腸靶向調(diào)控
        如何判斷靶向治療耐藥
        微小RNA在先天性巨結(jié)腸中的研究進展
        中國臨床醫(yī)學影像雜志(2021年6期)2021-08-14 02:21:56
        毛必靜:靶向治療,你了解多少?
        肝博士(2020年5期)2021-01-18 02:50:18
        提壺揭蓋法論治熱結(jié)腸腑所致咳嗽
        如何調(diào)控困意
        經(jīng)濟穩(wěn)中有進 調(diào)控托而不舉
        中國外匯(2019年15期)2019-10-14 01:00:34
        順勢而導 靈活調(diào)控
        SUMO修飾在細胞凋亡中的調(diào)控作用
        靶向超聲造影劑在冠心病中的應用
        欲色天天网综合久久| 亚洲视频在线免费不卡| 欧美老肥婆牲交videos| 伊人久久大香线蕉av一区| 国产高潮精品久久AV无码| 免费观看在线一区二区| 久久99久久99精品免观看不卡| 日韩字幕无线乱码免费| 寂寞人妻渴望被中出中文字幕| 亚洲av无码久久精品蜜桃| 色丁香在线观看| 偷柏自拍亚洲综合在线| 伊人久久大香线蕉av五月| 国内精品卡一卡二卡三| 国产啪精品视频网给免丝袜| 亚洲在线视频一区二区| 成人偷拍自拍视频在线观看| av无码精品一区二区三区宅噜噜| 天天狠狠综合精品视频一二三区| 亚洲av免费高清不卡| 国产日韩厂亚洲字幕中文| 成人欧美一区二区三区1314| 中文字幕经典一区| 骚货人妻视频中文字幕| 免费看美女被靠到爽的视频| 欧美人与动人物牲交免费观看| 国产91在线精品福利| 在线观看一区二区蜜桃| 免费观看羞羞视频网站| 91av手机在线观看| 用力草我小逼视频在线播放| 国产亚洲精品熟女国产成人| 中文字幕精品一二三四五六七八| 国产精品黄色片在线观看| 激情五月婷婷六月俺也去| 国产精品美女久久久网站三级| 久久无码专区国产精品s| 中文字幕在线久热精品| 亚洲人妻御姐中文字幕| 欧美乱大交xxxxx潮喷| 国产精品久久久久久久久KTV|