羅 婧，楊絲雨，吳 宇，王雨萌，鄭煜芳,

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 發(fā)育生物學(xué)研究所, 上海 200433; 2.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院, 上海 200011)

microRNA最早在1993年被報(bào)道發(fā)現(xiàn)[1]，是一類長(zhǎng)度為19～25nt的非編碼小RNA.通常microRNA通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR互補(bǔ)配對(duì)抑制靶基因的翻譯，降低其穩(wěn)定性.已有研究表明，microRNA 5’端的種子序列(seed sequence)會(huì)和靶基因mRNA的3’UTR通過(guò)完全堿基互補(bǔ)配對(duì)形成microRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(microRNA-Induced Silencing Complex, miRISC)，該復(fù)合物會(huì)介導(dǎo)mRNA的切割和降解[2].而microRNA與3’UTR區(qū)段不完全的堿基配對(duì)則主要導(dǎo)致mRNA的翻譯沉默[3].除了與3’UTR的常規(guī)相互作用外，最近的研究表明在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中microRNA也可以與靶基因mRNA的5’UTR區(qū)[4]或編碼區(qū)(CDS)結(jié)合[5-6].

microRNA介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)在發(fā)育和疾病調(diào)控中都發(fā)揮了重要的作用.我們實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)，MECP2復(fù)制會(huì)上調(diào)miR-197，并促進(jìn)大腦皮質(zhì)發(fā)育中的神經(jīng)發(fā)生[7].hsa-miR-197從1p13.3染色體轉(zhuǎn)錄，成熟的miR-197-3p具有22個(gè)核苷酸[8].miR-197直系同源基因僅在一些靈長(zhǎng)類動(dòng)物(人、恒河猴、西部大猩猩、侏儒黑猩猩、黑猩猩)和部分其他哺乳動(dòng)物，包括牛、狗、馬，山羊和兔子中被鑒定出，表明其在靈長(zhǎng)類動(dòng)物和這些哺乳動(dòng)物中具有重要的作用.此外，miR-197還是包括人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[9]在內(nèi)的幾種癌癥的生物標(biāo)志物[10].因此，我們?cè)趲追N人類細(xì)胞中尋找hsa-miR-197-3p的潛在靶基因，包括人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞hiPSC，人髓核細(xì)胞hNPC，人神經(jīng)元，人胚胎腎細(xì)胞293T和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251.我們一共鑒定出9個(gè)在這些細(xì)胞中均高表達(dá)的潛在靶基因，qRT-PCR結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-197的確可以下調(diào)大多數(shù)靶基因的表達(dá)，但是miR-197對(duì)異質(zhì)核糖核蛋白D0基因(HNRNPD)的表達(dá)卻有顯著的上調(diào)作用.

HNRNPD也被稱為富含AU的元件RNA結(jié)合蛋白1(AUF1)，能結(jié)合許多原癌基因和細(xì)胞因子mRNA的3’UTR上的AU-Rich Elements(AREs)[11-12].由于在2號(hào)外顯子或7號(hào)外顯子上的可變剪接，HNRNPD有4種亞型，其分子量分別為p37，p40，p42和p45.這4種亞型具有不同的亞細(xì)胞定位: p37和p40可以在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間穿梭，但在細(xì)胞質(zhì)中含量較多，而其他兩個(gè)亞型僅分布在細(xì)胞核[11].所有4種亞型都可以通過(guò)與AREs結(jié)合介導(dǎo)mRNA的快速降解，其中p37具有最高的結(jié)合親和力[13].此外，HNRNPD還可以通過(guò)結(jié)合靶基因的3’UTR區(qū)影響其翻譯水平.小鼠核心生物鐘基因Cry1的3’UTR區(qū)可以與HNRNPD結(jié)合，后者通過(guò)與翻譯起始因子相互作用并募集40S核糖體亞基來(lái)啟動(dòng)Cry1的翻譯[14].根據(jù)近期數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果，人類基因組中約22%的基因在其3’UTR上包含至少一個(gè)ARE[15].因此，HNRNPD可能影響許多基因的表達(dá).

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-197不調(diào)控HNRNPD的3’UTR，而是通過(guò)5’UTR上調(diào)HNRNPD的表達(dá).同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)發(fā)育障礙(如自閉癥和嚴(yán)重的智力障礙)相關(guān)基因中含有比全基因組中更高比例的ARE-mRNA.所以miR-197和HNRNPD在調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育和相關(guān)疾病中可能具有重要作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、miRNA mimics、抑制劑及引物

293T和U251細(xì)胞系均從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)獲得.miR-197 mimics及其對(duì)照，miR-197抑制劑及其對(duì)照均購(gòu)自Genepharma.在1 OD單鏈RNA oligo中加入125μL不含RNase的水制成20mmol/L溶液進(jìn)行儲(chǔ)存，工作濃度為50nmol/L.miR-197的引物和內(nèi)參U6引物均購(gòu)自Qiagen.

1.1.2 Ago2 shRNA

根據(jù)Ago2序列一共設(shè)計(jì)了3種shRNA，由和元生物有限公司將shRNA裝入過(guò)表達(dá)載體并用慢病毒包裝.具體5’-3’ shRNA序列如表1所示.

表1 Ago2 shRNA序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)293T和U251細(xì)胞，該培養(yǎng)基中添加了10%的胎牛血清(Gibco)和1%的青霉素-鏈霉素溶液(Beyotime Biotechnology).將細(xì)胞在37℃含5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 5種細(xì)胞miR-197潛在靶基因的GEO數(shù)據(jù)提取

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中提取了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)，人神經(jīng)祖細(xì)胞(hNPC)，人神經(jīng)元，U251細(xì)胞和293T細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)集.對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集的前1000個(gè)富集基因進(jìn)行提取，然后將每個(gè)細(xì)胞的靶基因的交集列表進(jìn)行進(jìn)一步分析.

GSM號(hào)碼如下:

人iPSC: GSM2884932，GSM2884933，GSM2884934，GSM2884935，GSM2884968，GSM2884969，GSM2884970，GSM2884971.人NPC: GSM2127240，GSM2127241，GSM2127242，GSM2127245，GSM2127246，GSM2127247，GSM2127248.人神經(jīng)元: GSM2884974，GSM2884975，GSM2884976，GSM2884986.U251細(xì)胞: GSM1681972，GSM1681973，GSM1681974.293T細(xì)胞: GSM3753369，GSM3755570.

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.3.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞傳代后接種到10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度到70%左右進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染.將轉(zhuǎn)染試劑和工作濃度為50nmol/L的miRNA或4μg質(zhì)粒按照2∶1的比例混合并用500μL opti-MEM進(jìn)行稀釋，靜置20min后，將上述混合溶液均勻滴加到細(xì)胞培養(yǎng)皿中.24h后收細(xì)胞.實(shí)驗(yàn)中涉及兩種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑: 單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-197 mimics或抑制劑及其對(duì)照時(shí)，用Lipofectamine RNAiMAX(Thermo fisher Scientific)；共轉(zhuǎn)染miR-197mimics或抑制劑及其對(duì)照和HNRNPD基因相關(guān)質(zhì)粒時(shí)使用X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑(Roche).

1.2.3.2 病毒轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞傳代后接種到12孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到30%左右進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)根據(jù)不同病毒的滴度按MOI=10在細(xì)胞中加入對(duì)應(yīng)的病毒，72h后收細(xì)胞.

1.2.4 RNA抽提和qRT-PCR

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取293T或U251細(xì)胞的總RNA.使用All-in-One TM miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒(GeneCopoeia)進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄和miR-197的qRT-PCR.使用帶有g(shù)DNA Remover的ReverTraAce?qPCR RT預(yù)混液(Toyobo)進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄，并用SYBR?Green Realtime PCR預(yù)混液(Toyobo)進(jìn)行mRNA的qRT-PCR.由于HNRNPD的所有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本都具有相同的3’UTR和5’UTR區(qū)，因此設(shè)計(jì)的qRT-PCR引物對(duì)應(yīng)所有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本的共享序列.引物序列如表2所示.

表2 qRT-PCR引物列表

1.2.5 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將全長(zhǎng)的HNRNPDmRNA 5’UTR或3’UTR序列克隆到質(zhì)粒載體pGL3中以生成熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒.使用Q5聚合酶(NEB)通過(guò)定點(diǎn)誘變生成不同位點(diǎn)的突變體，并通過(guò)Sanger測(cè)序進(jìn)行證實(shí).通常microRNAs上存在一段連續(xù)的7～8mer種子序列，該序列可以與其靶基因通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合[16].因此，我們通過(guò)將HNRNPD上與miR-197種子序列互補(bǔ)配對(duì)的7mer區(qū)段突變了3～4個(gè)堿基獲得了HNRNPD的突變型質(zhì)粒.并注意避免產(chǎn)生其他microRNA新的結(jié)合位點(diǎn).轉(zhuǎn)染前一天將U251細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種在24孔板上，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行miRNA、熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒以及Renilla表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染試劑為X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑(Roche)，miRNA的作用終濃度為50nmol/L，每孔所加熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和Renilla表達(dá)質(zhì)粒分別為0.5μg和0.1μg.轉(zhuǎn)染24h后檢測(cè)熒光素酶活性(Dual-Luciferase?Reporter Assay System，Promega).熒光素酶信號(hào)通過(guò)Renilla進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化.

1.2.6 Western blot

提取6孔板內(nèi)細(xì)胞時(shí)每孔加入150μL含有完整蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA(中等)蛋白裂解液(Beyotime)提取細(xì)胞蛋白，裂解處理后通過(guò)10%SDS-PAGE(Beyotime Biotechnology)進(jìn)行電泳分離.一抗來(lái)自Abcam，包括Vinculin抗體(ab129002)，HNRNPD抗體(ab61193)和Ago2抗體(ab186733).二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Beyotime Biotechnology).計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量時(shí)用Vinculin作內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并用Image J量化蛋白表達(dá)水平.

1.2.7 Biotin-miRNA pull down

轉(zhuǎn)染前一天將U251細(xì)胞傳代后接種到10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度到70%左右進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染.每皿轉(zhuǎn)染工作濃度為50nmol/L的帶生物素(biotin)修飾的miRNA-197mimics.轉(zhuǎn)染24h后收集全細(xì)胞裂解液，并添加磁珠以下拉帶生物素標(biāo)簽的miR-197以及與其結(jié)合的RNA.洗脫后，通過(guò)qRT-PCR測(cè)定內(nèi)源HNRNPD的mRNA表達(dá)水平.通過(guò)以下公式計(jì)算miRNA的富集: 相對(duì)mRNA結(jié)合倍數(shù)=(Bio miR-197 pull-down/Bio scramble pull-down)/(Bio miR-197 input/Bio scramble input).每個(gè)數(shù)據(jù)至少進(jìn)行3組獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).熒光素酶mRNA引物從Genewiz訂購(gòu)，引物序列見表3.

表3 Luciferase引物列表

1.2.8 疾病相關(guān)基因提取

從以下幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取不同疾病的相關(guān)基因: 自閉癥相關(guān)基因來(lái)自AutDB的4星及5星基因[17-18].高血壓相關(guān)基因來(lái)自http://bws.iis.sinica.edu.tw/THOD/.精神分裂癥相關(guān)基因來(lái)自SZDB[19].癲癇相關(guān)基因來(lái)自http://carpedb.ua.edu/.所有其他與疾病相關(guān)的基因均來(lái)自O(shè)MIM(https://omim.org/).通過(guò)ARED-PLUS[15]篩選所有疾病相關(guān)基因的AREs mRNA百分比，并用卡方檢驗(yàn)確定疾病和整個(gè)基因組中AREs mRNA的百分比是否有顯著差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 9個(gè)潛在靶基因中miR-197僅上調(diào)HNRNPD的表達(dá)

我們首先從miRDB[20]和targetscan[21]兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中各自預(yù)測(cè)了miR-197的潛在靶基因，然后取交集.由于miR-197在神經(jīng)干細(xì)胞分化和癌癥中的作用，我們檢查了預(yù)測(cè)的靶基因中有多少基因在hiPSC，hNPC，人神經(jīng)元，U251細(xì)胞和293T細(xì)胞中是在前1000高表達(dá)的基因(圖1(a)).我們將5種細(xì)胞分為兩組，將各細(xì)胞中上述高表達(dá)基因中的預(yù)測(cè)靶基因取交集，每組獲得了10個(gè)共有的高表達(dá)基因.這兩組中有9個(gè)基因是5種細(xì)胞共有且高表達(dá)的.因此，我們將這9個(gè)基因作為的miR-197靶基因的候選基因，分別是APL6IP1，CAPRIN1，CBX3，HNRNPD，HNRNPR，NCL，PGK1，RAN，ST13(圖1(b)).接著，我們用miR-197mimics或其對(duì)照轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-197對(duì)293T細(xì)胞中這些基因的影響.如圖2所示，除了HNRNPD，所有這些靶基因的mRNA表達(dá)量都在miR-197mimics的作用下顯著降低，只有HNRNPD的表達(dá)水平被miR-197上調(diào).

圖1 miR-197靶基因的預(yù)測(cè)

圖2 miR-197潛在靶基因在293T細(xì)胞中表達(dá)的驗(yàn)證

2.2 miR-197可以在mRNA和蛋白水平顯著上調(diào)HNRNPD的表達(dá)

我們用miR-197mimics或抑制劑(i-197)轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞以進(jìn)一步確認(rèn)miR-197對(duì)HNRNPD的作用.qRT-PCR結(jié)果表明在U251細(xì)胞中miR-197mimics顯著提高了miR-197的表達(dá)水平，而i-197則對(duì)其進(jìn)行了抑制(圖3(a,b)，第52頁(yè)).隨后，用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miR-197mimics或抑制劑后U251細(xì)胞中HNRNPD的mRNA表達(dá)水平.結(jié)果表明，miR-197mimics可以上調(diào)HNRNPD的表達(dá)水平約3.5倍(圖3(c)，第52頁(yè)).接著，我們用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞質(zhì)中HNRNPD的蛋白質(zhì)水平.與以前的報(bào)道類似，在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到HNRNPD p37和HNRNPD p40，而HNRNPD p37在U251細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平高于HNRNPD p40(圖3(d)，第52頁(yè)).因此，我們統(tǒng)計(jì)了HNRNPD p37的蛋白表達(dá)水平.結(jié)果表明，miR-197mimics顯著上調(diào)了HNRNPD p37的蛋白水平，而i-197則下調(diào)了HNRNPD p37的蛋白水平(圖3(d)).

圖3 miR-197在mRNA和蛋白水平上均上調(diào)HNRNPD的表達(dá)

2.3 miR-197通過(guò)5’UTR區(qū)上調(diào)HNRNPD表達(dá)

根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(7.2版)的預(yù)測(cè)，miR-197在HNRNPD的3’UTR上有一個(gè)8-mer的靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖4(a)，第52頁(yè)).因此，我們構(gòu)建了包含3’UTR全長(zhǎng)的野生型(3’UTR-WT)或突變型(3’UTR-MUT)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒.突變型3’UTR在預(yù)測(cè)位點(diǎn)包含3個(gè)點(diǎn)突變(圖4(a)).將miR-197mimics或抑制劑i-197與含HNRNPD3’UTR-WT或3’UTR-MUT的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示miR-197mimics或者i-197對(duì)于含HNRNPD3’UTR野生型和突變型報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶表達(dá)水平都沒(méi)有顯著影響(圖4(b)，第52頁(yè)).因此，HNRNPD的3’UTR很可能不是miR-197的作用靶點(diǎn).

圖4 HNRNPD的3’UTR不是miR-197的作用靶點(diǎn)

據(jù)前言中所述，已有報(bào)道表明microRNA也可能與靶基因的5’UTR相互作用[20].因此，我們檢查了HNRNPD的5’UTR序列，并根據(jù)RNAhybrid[22]中的自由能計(jì)算發(fā)現(xiàn)了4個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)(圖5(a)，第53頁(yè)).根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果，我們構(gòu)建帶有5’UTR全長(zhǎng)的野生型5’UTR-WT和4種突變型5’UTR-MUT1～4(序列如圖5(b～e)，第53頁(yè))的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒.將這些熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miR-197mimics或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞.同樣，miR-197顯著上調(diào)了5’UTR-WT的熒光素酶相對(duì)表達(dá)水平(圖5(f)).與5’UTR-WT相比，miR-197對(duì)HNRNPD的上調(diào)作用在MUT1中丟失(圖5(f))，其他3個(gè)位點(diǎn)的突變對(duì)于上調(diào)作用有一定程度的削弱，但是沒(méi)有MUT1顯著.因此，熒光素酶檢測(cè)結(jié)果表明miR-197是通過(guò)5’UTR而不是預(yù)測(cè)的3’UTR區(qū)和HNRNPD結(jié)合，而位點(diǎn)1是最重要的調(diào)控位點(diǎn).

圖5 miR-197作用于HNRNPD mRNA的5’UTR

2.4 miR-197通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)直接結(jié)合HNRNPD mRNA的5’UTR區(qū)

為了驗(yàn)證miR-197是否能與HNRNPD的mRNA直接結(jié)合，我們利用帶生物素標(biāo)記的miR-197mimics(miR-197*)進(jìn)行RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，然后用miR-197*結(jié)合的RNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn).我們首先利用U251細(xì)胞的內(nèi)源性RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，被miR-197mimics拉下的內(nèi)源性HNRNPDmRNA為對(duì)照組的2.36倍(圖6(a)).

為進(jìn)一步確認(rèn)HNRNPD與miR-197的結(jié)合位點(diǎn)，將HNRNPD3’UTR和5’UTR的熒光素酶報(bào)告基因在U251細(xì)胞過(guò)表達(dá)，然后進(jìn)行RNA pull-down和qRT-PCR實(shí)驗(yàn).這次qRT-PCR驗(yàn)證的是含有熒光素酶的mRNA，結(jié)果顯示miR-197*只與含5’UTR的報(bào)告基因mRNA結(jié)合(圖6(b))，而不與3’UTR報(bào)告基因的mRNA結(jié)合(圖6(c)).為了驗(yàn)證之前5’UTR的位點(diǎn)一是否對(duì)于HNRNPD和miR-197的結(jié)合也很重要，我們進(jìn)一步利用突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(5’UTR WT，5’UTR MUT1)與帶生物素標(biāo)簽的miR-197 mimics共轉(zhuǎn)染后進(jìn)行RNA pull-down和qRT-PCR實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明，當(dāng)HNRNPD的5’UTR位點(diǎn)1發(fā)生突變時(shí)，5’UTR MUT1喪失了與miR-197結(jié)合的能力(圖6(b)).上述結(jié)果提示，miR-197是通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)的方式直接結(jié)合HNRNPDmRNA的5’UTR.

圖6 miR-197通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)直接結(jié)合HNRNPD mRNA的 5’UTR

2.5 miR-197對(duì)HNRNPD蛋白的上調(diào)依賴于Ago2

在miRNA介導(dǎo)的基因激活中，Ago2是必不可少的[23].我們首先用3種不同的Ago2 shRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)均能顯著下調(diào)AGO2的表達(dá)水平(圖7(a，b)).

然后，我們使用其中Ago2-sh1和Ago2-sh2與miR-197mimics進(jìn)行共轉(zhuǎn)染.Western blot結(jié)果顯示，此時(shí)只有Ago2-sh1對(duì)Ago2依然有下調(diào)作用(圖7(c),(d)).有趣的是，當(dāng)Ago2表達(dá)量顯著降低時(shí)，miR-197失去了對(duì)HNRNPD的上調(diào)作用(圖7(c),(e)).因此，miR-197對(duì)HNRNPD的上調(diào)是依賴于Ago2的.

3 討 論

本項(xiàng)工作中，我們發(fā)現(xiàn)miR-197結(jié)合的是HNRNPD的5’-UTR序列.盡管有越來(lái)越多的生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)miRNA與5’UTR的相互作用[24]，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)microRNA通過(guò)5’UTR對(duì)靶向mRNA起上調(diào)作用的報(bào)道依然較少.在本研究之前，miRNA只通過(guò)5’UTR上調(diào)靶基因的報(bào)道僅有4例.除miR-122對(duì)丙型肝炎病毒的調(diào)控外[25-27]，僅有miR-10a，miR-346和miR196b 3個(gè)miRNA被證實(shí)能夠通過(guò)靶向結(jié)合5’UTR激活翻譯.miR-10a通過(guò)與5’UTR結(jié)合來(lái)刺激核糖體蛋白mRNA的翻譯[28].miR-346可以通過(guò)5’UTR上調(diào)RIP140的表達(dá)[29].miR-196b通過(guò)5’UTR上調(diào)Insulin2的表達(dá)[30].上述4個(gè)miRNA的這些報(bào)告均是miRNA通過(guò)5’UTR對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行翻譯水平的調(diào)控.此外，只有一例報(bào)道證明miRNA可以同時(shí)下調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯: miR-103a-3p可以靶向結(jié)合GPRC5A的5’UTR以下調(diào)其mRNA和蛋白質(zhì)水平[31].我們的結(jié)果證明了miR-197可以同時(shí)上調(diào)HNRNPD的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，并且miR-197對(duì)于HNRNPD翻譯的上調(diào)是依賴于Ago2的.已知在RNA介導(dǎo)的基因沉默中，Ago2蛋白是沉默復(fù)合體(RISC)的核心組成部分.而在RNA介導(dǎo)的基因激活中，Ago2蛋白同樣起到識(shí)別、招募小RNA形成復(fù)合物的作用[32].如受dsRNA上調(diào)的E-cadherin，p21和VEGF在敲除Ago2后，原有的RNA激活效應(yīng)幾乎被完全抑制[23].另一方面，對(duì)比不同哺乳動(dòng)物(人、恒河猴、狗、馬、山羊等)HNRNPD的5’-UTR序列，HNRNPD的5’-UTR區(qū)域在這些物種中具有高保守性，且miR-197靶向結(jié)合HNRNPD的5’-UTR位點(diǎn)1也相對(duì)保守，提示在這些物種中miR-197均可能對(duì)HNRNPD有調(diào)控作用.具體miR-197是如何上調(diào)HNRNPD的RNA水平的，則有待進(jìn)一步深入研究.

另一個(gè)挑戰(zhàn)是要了解HNRNPD和miRNA之間復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò).HNRNPD不僅參與ARE-mRNA的降解，還參與調(diào)控miRNA的合成和其他功能.據(jù)報(bào)道，HNRNPD可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵miRNA加工者DICER1的mRNA[33].此外，HNRNPD可通過(guò)幫助miRNA加載至Ago2來(lái)促進(jìn)miRNA介導(dǎo)的基因沉默[34].但是，HNRNPD也可以與miRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合3’UTR中的ARE，從而阻斷miRNA的功能[35].研究中，我們證實(shí)miR-197可以上調(diào)HNRNPD，但HNRNPD是否可以對(duì)miR-197進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，以及miR-197對(duì)其他mRNA和miRNA的影響有待進(jìn)一步研究.

HNRNPD的生理功能目前還不是特別清楚.HNRNPD在胚胎的腦部有高表達(dá)[38-39]，特別是在大鼠的大腦皮層發(fā)育高峰期[38].因此，HNRNPD很可能也參與了神經(jīng)發(fā)育和相關(guān)疾病的調(diào)控.我們搜索了人遺傳疾病公共數(shù)據(jù)庫(kù)DECIPHER[40]，發(fā)現(xiàn)其中共記錄了34個(gè)攜帶HNRNPD的拷貝數(shù)變異(CNV)的臨床樣本，在這些樣本中有23例(67.6%)患有嚴(yán)重的智力障礙、自閉癥、整體發(fā)育遲緩或語(yǔ)言發(fā)育遲緩.

此外，已有研究發(fā)現(xiàn)HNRNPD可以促進(jìn)mRNA快速降解[36]，這一作用主要是通過(guò)與富含AU元件(AREs)的mRNA結(jié)合實(shí)現(xiàn)的[11,37].因此，我們還探索分析了一些主要神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的相關(guān)基因是否含有AREs以及含有AREs的基因所占的比例.我們從多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)AutDB[17-18]、SZDB[19]和OMIM中提取了與自閉癥，嚴(yán)重智力障礙，語(yǔ)言發(fā)育遲滯，精神分裂癥，癲癇病，神經(jīng)管缺陷，先天性心臟病和高血壓相關(guān)的核心基因.上述所有疾病相關(guān)核心基因均通過(guò)ARED-PLUS[15]篩查AREs mRNA的百分比，結(jié)果如表4所示.按ARED-PLUS之前的分析，全基因組中約有22%的基因含有AREs[15].而在119個(gè)自閉癥相關(guān)基因中，有52個(gè)(43.7%)含有ARE，幾乎是全基因組水平的2倍.此外，在其他幾種神經(jīng)發(fā)育障礙中，包括嚴(yán)重智力障礙、語(yǔ)言發(fā)育遲滯相關(guān)基因中，含有AREs的基因比例也顯著高于全基因組.

表4 AREs-mRNA在各疾病相關(guān)基因中所占的比例

因此，HNRNPD基因異常和其調(diào)控異常很可能與神經(jīng)發(fā)育障礙疾病相關(guān).雖然HNRNPD基因敲除的小鼠模型表型為炎癥反應(yīng)失調(diào)，而沒(méi)有明顯的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷[41].但是，DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)中大多數(shù)攜帶HNRNPD的CNV的人類患者具有嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育障礙.這種差異可能是由于動(dòng)物模型不夠準(zhǔn)確以及人腦的結(jié)構(gòu)和功能比小鼠更復(fù)雜導(dǎo)致的.因此，后續(xù)需要對(duì)人群的HNRNPD進(jìn)行更多的遺傳學(xué)研究，以充分了解其在人腦發(fā)育中的功能.