鄧征宇

（湖南省永州市冷水灘區(qū)畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心 425000）

志賀氏菌屬于革蘭陰性菌，在顯微鏡下呈桿狀且觀察到?jīng)]有鞭毛、有菌毛，是常見(jiàn)腸道致病菌，其引起的細(xì)菌病是影響公共衛(wèi)生的人畜共患病之一。志賀菌在到達(dá)結(jié)腸后，首先會(huì)侵入結(jié)腸上皮細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，然后擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞，最終引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[1]。目前為止，通過(guò)不同的抗原差異將志賀氏菌分為痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌和宋內(nèi)志賀氏菌，共鑒定出約55 種血清型。在養(yǎng)殖業(yè)中，志賀氏菌的感染會(huì)迅速傳播，如果處理不及時(shí)，會(huì)造成不可挽回的損失。

本文從感染志賀菌病的肉雞中分離出31 株志賀氏菌分離株，通過(guò)致病性評(píng)估篩選出強(qiáng)致病性菌株。以強(qiáng)致病性菌株感染30 日齡肉雞，建立了動(dòng)物治療模型。為后續(xù)噬菌體治療試驗(yàn)建立了基礎(chǔ)[2]。

1 材料與方法

1.1 志賀氏菌的分離純化，致病性評(píng)估

細(xì)菌分離自感染志賀菌病的肉雞黏膜中。刮取感染志賀氏菌的肉雞腸道黏膜物1g，溶于10ml 無(wú)菌水中混勻，通過(guò)不同梯度稀釋后取100μl 在SS （志賀菌與沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基）培養(yǎng)基進(jìn)行涂布。挑取單個(gè)粉色菌落進(jìn)行純化，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取后進(jìn)行16Sr DNA 鑒定。

為了評(píng)估分離菌株的致病性，選取志賀氏菌分離株進(jìn)行富集培養(yǎng)后以每只肉雞終濃度約為5×107CFU 的量進(jìn)行灌喂，此試驗(yàn)每組為5 只肉雞，觀察24h 內(nèi)肉雞的變化。

1.2 動(dòng)物治療模型建立

篩選出強(qiáng)致病性志賀氏菌分離株后，以1×106CFU，1×107CFU，1×108CFU 的量對(duì)30 日齡肉雞進(jìn)行灌喂感染。通過(guò)觀察肉雞的糞便、精神狀態(tài)及每克糞便中志賀氏菌的含量來(lái)選取最佳細(xì)菌灌喂量。對(duì)致病性效果優(yōu)異的分組，將肉雞在不同時(shí)間進(jìn)行解剖，觀察肉雞體內(nèi)器官病變狀況。

2 結(jié)果

2.1 志賀氏菌的分離純化，致病性評(píng)估

從感染志賀菌病的肉雞腸道中分離出BDS3-BDS33 共計(jì)31株志賀菌分離株，以肉雞為動(dòng)物模型進(jìn)行了致病性比較試驗(yàn)。結(jié)果表明，志賀氏菌分離株BDS8 相較于其他分離株有更強(qiáng)的致病性，肉雞在灌喂BDS8 菌液后精神萎靡，進(jìn)食量減少，在2h 左右出現(xiàn)腹瀉，且在12h 出現(xiàn)血便，持續(xù)至24h 也并未出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。篩選出BDS8 用于后續(xù)的動(dòng)物治療試驗(yàn)。

2.2 動(dòng)物治療模型建立

篩選出強(qiáng)致病性志賀氏菌分離株BDS8，以1×106CFU，1×107CFU，1×108CFU 的量對(duì)30 日齡肉雞進(jìn)行灌喂。發(fā)現(xiàn)灌喂1×108CFU 的量時(shí)肉雞在2h 開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉且精神萎靡，一直持續(xù)至24h 并未自愈。取肉雞糞便檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，每克糞便中志賀氏菌的含量在2h 開(kāi)始增長(zhǎng)，在4h 左右達(dá)到頂峰，24h 后并未恢復(fù)正常水平（圖1）。對(duì)感染前，感染7d，感染15d 的肉雞進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)感染15d 的肉雞炎癥嚴(yán)重，心臟腫大且被黃色心包膜包被，腸系膜出血明顯（圖2）。

3 討論

在本研究中，我們從感染志賀氏菌的肉雞中分離出了31株志賀氏菌，命名為BDS3-BDS31。之后以健康肉雞為載體，對(duì)志賀氏菌分離株進(jìn)行致病性評(píng)估，通過(guò)觀察肉雞精神狀態(tài)、糞便性狀篩選出強(qiáng)致病性志賀氏菌分離株BDS8。使用BDS8 以3 個(gè)不同的劑量進(jìn)行灌喂，發(fā)現(xiàn)以1×108CFU 灌喂的肉雞在感染后2h 開(kāi)始出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，一直持續(xù)至24h。在對(duì)糞便進(jìn)行微生物檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)在灌喂BDS8 菌液之后，糞便中志賀氏菌的含量明顯上升。且在4h 到達(dá)頂峰。同時(shí)，在灌喂菌液的24h 后，糞便中的志賀氏菌含量依舊沒(méi)有恢復(fù)至正常水平。在對(duì)感染0、5、15d 的肉雞進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，感染15d 的肉雞心臟腫大且有炎癥，腸系膜出血嚴(yán)重。

圖1 BDS8 以108 CFU 的量灌喂后每克糞便中志賀氏菌含量變化

近些年，畜牧業(yè)發(fā)展十分迅速，其中肉雞產(chǎn)量、銷(xiāo)量都有大幅提升，同樣，雞肉消費(fèi)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，2019 年中國(guó)肉雞出欄數(shù)量已接近100 億只[3]。對(duì)于細(xì)菌致病性的研究，能在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中通過(guò)觀察解剖快速判斷感染的細(xì)菌種類(lèi)，也是為尋找更高效的治療方法鋪橋搭路。

圖2 感染肉雞解剖圖