何裕智，李俊

放射治療過程中，不可避免地會對周圍組織造成損傷，導(dǎo)致急性或慢性放射性損傷，當(dāng)直腸黏膜受損時(shí)便會引發(fā)放射性直腸炎(radiation proctitis，RP)，是臨床放射治療主要并發(fā)癥[1]。該病主要見于婦科惡性腫瘤或男性前列腺惡性腫瘤放射治療，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病五年發(fā)病率為12.3%，其中有1.1%的患者確診為嚴(yán)重直腸炎[1]。便血、腹瀉及腸梗阻是該病主要臨床表現(xiàn)，病程較長，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)直腸陰道瘺或膀胱瘺，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)[2]，放射性損傷與放射性途徑相關(guān)基因有關(guān)，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)基因是研究較多的與放射損傷相關(guān)的有關(guān)基因之一。TGF-β1/Smad信號通路在電離輻射導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。因此，可設(shè)想通過阻斷TGF-β1/Smad信號通路來達(dá)到治療RP的目的。消痔靈注射液是一種中西藥相結(jié)合的注射用液體，能使小動(dòng)脈內(nèi)血栓形成加快，具有收斂、抑菌、止血等作用[4]。本文將采用消痔靈注射液治療放射性直腸損傷，探究該藥通過TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

雄性SD大鼠40只，SPF級，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：SCKX川2020-030。將大鼠放在室溫15～25 ℃，濕度35%～60%，添加常規(guī)飲水及飼料，12 h光照，12 h黑暗，循環(huán)進(jìn)行。

主要試劑及儀器：TGF-β1、Smad 2/3 抗體(Abcam，批號：ab64175、ab63399)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit)(Fermentas，批號：00130608)；高純總RNA快速提取試劑盒(Gener-ay，批號：1305G0)；GAPDH Antibody(Bioworld，批號：321205)；HE 染色試劑盒(北京索萊寶，批號：G1120)；中性樹膠(北京索萊寶，批號：G8590)；北京天普UV-1600紫外分光光度計(jì)；顯微鏡(日本尼康，Eclipse 80i)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司，型號TS-8)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠，型號DYCZ-20C)；直線加速器用瓦里安(Varian)6EX直線加速器(美國)；臺式冷凍高速離心機(jī)(德國 Eppendorf，Centrifuge 5430R)；臺式低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司，TDZ5-WS)。

1.2 分組及動(dòng)物模型制作

將40只大鼠分為空白對照組、模型組、消痔靈組、TGF-β1組、TGF-β1聯(lián)合消痔靈組，各8只。對照組不做任何處理，采用蛋白質(zhì)含量20%的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其他四組均予以固定照射，制作RP模型(圖1)。模型制作方法：大鼠肌肉完全松弛后，將大鼠安靜地以仰臥體位固定在特制的固定木板上，采用6 MV X射線單次25 GY照射，照射范圍自恥骨聯(lián)合至肛門，照射野面積3 cm×4 cm，放射劑量為20 Gy，劑量率500 cGy/min，仔細(xì)觀察大鼠接受照射時(shí)的情況。消痔靈組在照射后第12周采用消痔靈注射液(吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號 Z22026175)，每晚一次，2 mL/次，間隔一天灌腸1次共7次14 d。TGF-β1組在照射后第4周開始腹腔注射10 mg TGF-β1抑制劑SB-431542，共注射10 d。TGF-β1聯(lián)合消痔靈組，照射后第4周開始腹腔注射10 mg SB-431542，共注射10 d；第12周開始給予藥物灌腸，方法同消痔靈組灌腸方法。

模型鑒定：每天記錄5組大鼠一般狀況，包括大鼠的體質(zhì)量、反應(yīng)狀態(tài)活動(dòng)情況、飲水進(jìn)食量、大便情況等項(xiàng)目。除空白組外，其他四組大鼠在照射后出現(xiàn)如精神疲憊、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少、飲食飲水減少等情況；大鼠大便帶血，經(jīng)八聯(lián)試紙檢測，結(jié)果為潛血陽性[5]。

1.3 指標(biāo)檢測方法

干預(yù)結(jié)束后2周，所有大鼠采集腹主動(dòng)脈血標(biāo)本5 mL，用于炎性因子[白細(xì)胞介素2(Interleukin-2，IL-2)、白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)]水平檢測；處死，自距肛門2 cm以上獲取直腸組織約2 cm，平均分成兩部分，一部分放在10%的甲醛固定液中，用于HE染色；另一部分-80 ℃凍存，用于檢測TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)情況。

圖1 大鼠造模過程及成模后圖片 A圖：造模中；B圖：造模前固定；C圖：中度出血；D圖：輕度出血；E圖：重度出血(伴肛門功能異常)

1.3.1 采用HE染色觀察直腸組織病理改變

制備病理切片：取以上凍存組織，水洗后酒精梯度脫水，切去適當(dāng)形狀，采用石蠟包埋；使用輪轉(zhuǎn)機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為5 μm；切片置于42 ℃烤片機(jī)，烤片結(jié)束后進(jìn)行HE染色。

HE染色：切片二甲苯脫臘，乙醇梯度沖洗，再用雙蒸水沖洗2 min后開始染色；蘇木素液染色15 min后自來水沖洗，分化液分化30 s、自來水浸泡5 min；伊紅染液染色1min后，自來水沖洗，浸泡5min；將切片放入梯度乙醇中脫水，風(fēng)干后中性樹膠封片。

1.3.2 采用Western blotting檢測直腸組織TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)量

稱取各組大鼠100 mg直腸組織，置于勻漿器，將其剪碎；加入1 mL RIPA裂解液，10 μL PMSF，研磨碾碎組織；將研磨后的組織置于冰上裂解1 h后，裂解液移至離心管，12 000 r/min離心條件離心15 min，分離上清液，-80 ℃保存；采用BCA蛋白定量測定法測定蛋白總濃度。采用Western blotting技術(shù)檢測直腸組織中TGF-β1相關(guān)蛋白表達(dá)情況，首先SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，搖床低速室溫封閉2 h；將PVDF膜浸沒在一抗中孵育，4 ℃過夜，GAPDH稀釋比為1∶5 000，TGF-β1、Smad2、Smad3稀釋比為1∶700；回收一抗后加入TBST搖床3次，將PVDF膜浸沒在二抗中，搖床低速孵育1 h；加入TBST高速洗膜3次；將 PVDF 膜放在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)的黑色托盤上，曝光影像，采用開 Image Lab5.1 軟件分析蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3.3 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-2、IL-6、TNF-α水平

將血液標(biāo)本3 000 r/min離心處理10 min后，分離血清，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法(貝克曼庫爾特，AU5800全自動(dòng)生化分析儀)檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 直腸組織HE染色結(jié)果

肉眼觀察：對照組大鼠直腸組織黏膜顏色粉紅，未見明顯的充血；模型組大鼠直腸組織黏膜顏色暗紅，可見明顯組織充血、腫脹及大小不等的潰瘍點(diǎn)；TGF-β1組大鼠直腸組織外觀較模型組明顯改善；消痔靈組大鼠直腸組織黏膜顏色鮮紅，接近對照組，輕度充血、水腫，潰瘍斑點(diǎn)較少；TGF-β1聯(lián)合消痔靈組大鼠直腸組織改善效果較消痔靈組有所改善。

顯微鏡觀察：對照組大鼠直腸組織結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠直腸黏膜上皮可見明顯水腫及炎性改變，腺體結(jié)構(gòu)不完整，組織損傷特征明顯；消痔靈組大鼠直腸黏膜上皮未見明顯水腫，腺體大部分細(xì)胞修復(fù)，腺體結(jié)構(gòu)基本完整，僅黏膜下組織輕度充血；TGF-β1組大鼠直腸組織結(jié)構(gòu)較模型組優(yōu)，與TGF-β1聯(lián)合消痔靈組比較有顯著差異，聯(lián)合消痔靈注射液治療能進(jìn)一步改善大鼠病理改變，見圖2。

圖2 各組直腸組織HE染色結(jié)果(HE×200) A：對照組；B：模型組；C：消痔靈組；D：TGF-β1組；E：TGF-β1聯(lián)合消痔靈組

2.2 各組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)量比較

模型組直腸組織TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)；消痔靈組、TGF-β1組、TGF-β1聯(lián)合消痔靈組直腸組織TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)；TGF-β1聯(lián)合消痔靈組直腸組織TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)量顯著低于消痔靈組、TGF-β1組(P<0.05)；消痔靈組直腸組織TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)量與TGF-β1組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖3。

表1 各組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)量

圖3 各組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá) A：對照組；B：模型組；C：消痔靈組；D：TGF-β1組；E：TGF-β1聯(lián)合消痔靈組

2.3 各組炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較

模型組血清IL-2、IL-6、TNF-α水平顯著高于對照組(P<0.05)；消痔靈組、TGF-β1組、TGF-β1聯(lián)合消痔靈組血清IL-2、IL-6、TNF-α水平顯著低于模型組(P<0.05)；TGF-β1聯(lián)合消痔靈組血清IL-2、IL-6、TNF-α水平顯著低于消痔靈組、TGF-β1組(P<0.05)；消痔靈組血清IL-2、IL-6、TNF-α水平與TGF-β1組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α水平

2.4 便血療效分析

對照組大鼠及其它四組大鼠照射前大便次數(shù)正常，質(zhì)地較硬，未見便血等情況。照射第2天內(nèi)出現(xiàn)稀便、黏液膿血便，大便潛血檢測均先后呈陽性。便血檢測呈陰性(-)、可疑陽性(±)視為治療有效，呈陽性(+)、中等陽性(++)及強(qiáng)陽性(+++)為治療無效。消痔靈組、TGF-β1組、TGF-β1聯(lián)合消痔靈組大鼠便血療效分別為75.00%、50.00%、87.50%，見表3。

表3 便血療效分析 [n(%)]

3 討論

RP是腹腔、盆腔腫瘤放射治療后出現(xiàn)的一種并發(fā)癥，是腸道非特異性炎癥。西醫(yī)治療RP以鎮(zhèn)痛、止血、抗感染及減輕胃腸道痙攣等對癥治療為主，同時(shí)輔以飲食、腸道營養(yǎng)治療及高壓氧治療[6]。中醫(yī)通過分析該病腹瀉、便血及腹痛三大主要癥狀，結(jié)合高能電離輻射病因，將其歸為“泄瀉”范疇[7]，認(rèn)為該病病位在腸，病因?yàn)楦吣茈娏椛?，病機(jī)為熱毒蘊(yùn)結(jié)致使脾胃腸道受損。故中醫(yī)治療多以清熱燥濕止血、涼血滋陰養(yǎng)血為原則，在此基礎(chǔ)上根據(jù)病情變化加減[8]。消痔靈注射液為中成藥，主要成分為五味子提取物、明礬等，具有消炎、抑菌、收斂、止血功效。該藥含有鞣酸、低分子右旋糖酐、枸櫞酸鈉、亞硫酸氫鈉等化學(xué)成分，對靜脈曲張性混合痔出血具有較好療效，可使用藥區(qū)局部組織出血性壞死，進(jìn)而發(fā)揮止血作用[9]。

近年來，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的提出使綜合性分析RP病理機(jī)制成為重點(diǎn)，致力于研究該病治療方法在分子水平的作用機(jī)制。TGF-β是一種促纖維化因子，能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖分化。研究表明，TGF-β及其信號通路在動(dòng)物腸道疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，可通過調(diào)節(jié)干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)的信號傳導(dǎo)，抑制腸道炎癥的發(fā)生[10]。Smads蛋白家族是TGF-β家族信號傳導(dǎo)的主要介質(zhì)，是TGF-β受體直接作用底物，TGF-β/Smad信號通路表達(dá)異常及失常會導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制性功能障礙[11-12]。TGF-β1作為TGF-β家族中的重要一員，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究報(bào)道[13-14]，放射治療患者血清中TGF-β1水平與組織放射性損傷有關(guān)。Smads介導(dǎo)的TGF-β信號途徑及其生物學(xué)效應(yīng)，在放射性組織損傷中起至關(guān)重要的作用[15-17]。GTGF是一種多肽，TGF-β/Smad通路下游重要靶基因，研究證實(shí)[18-19]，TGF-β可通過TGF-β/Smad通路促進(jìn)下游GTGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。

為探究消痔靈注射液介導(dǎo)TGF-β1/Smad通路治療RP的分子機(jī)制，本研究制作了RP大鼠模型，模型大鼠在照射后出現(xiàn)精神疲憊、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少及便血等癥狀；另外直腸組織黏膜顏色暗紅，明顯組織充血、腫脹，且直腸組織TGF-β1表達(dá)量較正常對照組顯著上升，說明大鼠RP模型制作成功。消痔靈組TGF-β1、Smad2/3蛋白表達(dá)較模型組顯著下降，提示消痔靈注射液有抑制TGF-β1、Smad2/3的表達(dá)作用。采用TGF-β1抑制劑干預(yù)RP模型大鼠，發(fā)現(xiàn)其TGF-β1、Smad2/3蛋白表達(dá)較模型組顯著下調(diào)，在此基礎(chǔ)上采用消痔靈注射液治療，發(fā)現(xiàn)直腸組織中TGF-β1、Smad2/3蛋白表達(dá)量與抑制劑組比較無顯著差異，進(jìn)一步提示消痔靈注射液主要通過介導(dǎo)TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮抗RP出血作用。TGF-β還能聚集炎癥細(xì)胞，促進(jìn)釋放大量炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-4、IL-6、IL-13等[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α水平較正常對照組顯著上升，TGF-β1組炎性因子水平較模型組有所下降，消痔靈組和TGF-β1聯(lián)合消痔靈組大鼠血清炎性因子水平均明顯下降，但組間比較有顯著差異，后者下降水平更加明顯，說明消痔靈注射液可通過TGF-β1/Smad信號通路在RP出血中發(fā)揮抗炎作用；TGF-β1聯(lián)合消痔靈組炎性因子下降水平較TGF-β1組明顯，提示消痔靈注射液還可能通過其他信號途徑發(fā)揮抗炎作用。照射前各組大便質(zhì)地較硬，未見便血，照射后出現(xiàn)黏液膿血便，大便潛血檢測均先后呈陽性，消痔靈注射液及TGF-β1抑制劑干預(yù)后，各組大鼠便血情況得到改善，消痔靈組和TGF-β1聯(lián)合消痔靈組療效較高，有效率分別為80%、90%，提示消痔靈注射液可能通過其他通路或者機(jī)制治療RP，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，消痔靈注射液能夠下調(diào)RP組大鼠直腸組織中TGF-β1、Smad2/3表達(dá)，該藥治療治療RP出血主要通過介導(dǎo)TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮作用，但其具體藥理作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。