王丹，黃健，陳彩霞，李策力格，劉偉

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 老年病區(qū)，呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科，呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)研究中心，呼和浩特 010010)

RA是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的累及全身多系統(tǒng)的慢性、非特異性、炎癥性疾病，其關(guān)節(jié)病變呈進(jìn)行性發(fā)展，不可逆性加重[1-2]。RA好發(fā)于中年人群，女性發(fā)病多于男性，發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，其基本病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎癥浸潤(rùn)[3-4]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box protein 1，HMGB1)作為一種潛在的炎癥誘導(dǎo)因素與多種自身免疫性疾病相關(guān)，目前已有研究發(fā)現(xiàn)其與RA的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)RA患者血清HMGB1的水平，分析其與RA疾病活動(dòng)性、炎性因子及臨床檢查指標(biāo)的相關(guān)性，探討HMGB1在RA病情發(fā)展演變中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組選取2017年12月至2018年6月于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科住院治療的RA患者60例納入研究，其中男性49例、女性11例，年齡(49±8)歲，RA患者中活動(dòng)期(急性期)組患者30例，非活動(dòng)期(緩解期)組患者30例，疾病診斷與疾病分期標(biāo)準(zhǔn)符合2010年版美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組來(lái)源于同期內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院保健體檢中心的健康體檢者30例，均為隨機(jī)納入，其中男性24例、女性6例，年齡(50±11)歲。2組間性別及年齡構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。排除標(biāo)準(zhǔn)：于納入研究前6周內(nèi)有影響免疫功能的藥物服用史者，如服用激素者、服用免疫抑制劑者；于納入研究前4周內(nèi)有感染病史者。本研究中臨床血液樣本的采集均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且患者及家屬簽署了知情同意書。

1.2 試劑與儀器HMGB1 ELISA試劑盒(日本SHINO-TEST公司)；IL-6、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)ELISA試劑盒(英國(guó)Abcam 公司)；NEO HTS型全功能微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)Synergy公司)；MONITOR-20自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化血沉儀(意大利Vital公司)；ARCHITECT c4000全自動(dòng)分析儀(美國(guó)Abbott公司)。

1.3 方法采集并記錄納入研究的RA患者及健康對(duì)照者的相關(guān)病史。抽取研究對(duì)象晨起空腹肘正中靜脈血3～4 mL，以1 000×g離心10 min，取上清液于-20 ℃保存待測(cè)。所有研究對(duì)象的血清樣本于其入院后1周內(nèi)采集完畢。使用定量HMGB1 ELISA試劑盒測(cè)定血清HMGB1水平，NEO HTS型全功能微孔板檢測(cè)儀讀取光密度[D(450 nm)]，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線間接計(jì)算HMGB1的含量。使用定量ELISA試劑盒測(cè)定血清IL-6、IL-8及MMP-3水平，NEO HTS型全功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)D(450 nm)，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-6、IL-8及MMP-3的含量。血清ESR的測(cè)定采用紅外線障礙法，儀器使用MONITOR-20自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化血沉儀。血清CRP、RF的測(cè)定采用免疫比濁法，儀器使用ARCHITECT c4000全自動(dòng)分析儀。

2 結(jié)果

2.1 血清HMGB1表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)性的相關(guān)性活動(dòng)期組RA患者血清HMGB1表達(dá)水平[(10.13±1.45)ng/mL]顯著高于非活動(dòng)期組[(8.00±1.46) ng/mL]和健康對(duì)照組[(7.68±1.61)ng/mL](均P<0.01)；非活動(dòng)期組RA患者HMGB1水平略高于健康對(duì)照組，但2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，血清HMGB1表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)性呈正相關(guān)(r=0.547，P<0.05)。

2.2 血清IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP、RF表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)性的相關(guān)性活動(dòng)期組及非活動(dòng)期組RA患者血清IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP、RF表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組，且活動(dòng)期組高于非活動(dòng)期組，3組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，血清IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP、RF表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)性呈正相關(guān)(r值分別為0.938、0.939、0.916、0.915、0.907、0.927，均P<0.05)。

表1 各組血清IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP、RF表達(dá)水平的比較

2.3 血清HMGB1水平與IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP及RF表達(dá)水平的相關(guān)性經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，RA患者血清HMGB1水平與IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP、RF表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.539、0.558、0.550、0.515、0.509、0.518，均P<0.05)。

3 討論

HMGBl最初在20世紀(jì)60年代由Johns發(fā)現(xiàn)，因其在Western blotting的SDS-PAGE中遷移率高而得名，是一種在大多數(shù)真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)、高度保守的非組蛋白核蛋白，存在于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外[5-6]。細(xì)胞內(nèi)的HMGB1主要參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)，類固醇激素調(diào)控和細(xì)胞分化成熟[7]；細(xì)胞外的HMGB1可與內(nèi)、外源性促炎因子結(jié)合形成復(fù)合物，以協(xié)同刺激的方式在炎癥反應(yīng)中起重要作用[8-9]。因此，HMGB1的異常表達(dá)對(duì)于相關(guān)疾病病情的發(fā)展及演變具有重要意義。相關(guān)研究證實(shí)，RA患者滑膜液中HMGB1的表達(dá)水平升高，但目前國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界對(duì)于RA患者血清HMGB1的異常表達(dá)與否尚存爭(zhēng)議[10]。早期有學(xué)者對(duì)30例RA患者的樣本進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，RA患者血清HMGB1水平與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[11]。但另有相關(guān)研究對(duì)67例活動(dòng)期RA患者和21例健康對(duì)照者進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，活動(dòng)期RA患者血清HMGB1水平明顯升高，與健康對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[12]。還有一項(xiàng)研究納入105例樣本，結(jié)果顯示，RA患者血清HMGB1水平明顯高于健康對(duì)照組，其活動(dòng)期表達(dá)水平明顯高于非活動(dòng)期(P<0.05)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期組RA患者血清HMGB1水平顯著高于非活動(dòng)期組和健康對(duì)照組(均P<0.05)，非活動(dòng)期組RA患者血清HMGB1水平與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究間差異可能與樣本量及檢測(cè)手段不同有關(guān)，但本研究及多數(shù)國(guó)內(nèi)研究結(jié)果表明，活動(dòng)期組RA患者血清HMGB1表達(dá)水平較非活動(dòng)期組及健康對(duì)照組顯著上調(diào)。這提示HMGB1在RA的疾病發(fā)展演變過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其在血清中的表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)性呈正相關(guān)，也為通過(guò)血清HMGB1水平反應(yīng)臨床RA活動(dòng)性的設(shè)想提供了理論依據(jù)。

IL-6是關(guān)節(jié)疾病中研究得最多的炎性因子，其參與了多種自身免疫性疾病的病程。IL-6在病理情況下可通過(guò)多種分泌形式在全身發(fā)揮致病效應(yīng)。研究顯示，IL-6可刺激滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成并分泌前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)及膠原酶，作用于關(guān)節(jié)軟骨及骨組織，引起并加重關(guān)節(jié)損傷[14]。IL-8又稱趨化因子CXCL8，可募集并激活中性粒細(xì)胞，引起局部或全身的炎癥反應(yīng)。研究顯示，IL-8可由RF刺激形成，其作用于關(guān)節(jié)滑膜組織引起滑膜炎性增生，且在關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥的維持中起重要作用[1]。MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶家族，是引起細(xì)胞外基質(zhì)破壞的主要因素，參與組織侵蝕破壞性疾病的致病過(guò)程。其中膠原酶特異性地水解膠原蛋白，明膠酶參與分解明膠和基底膜膠原，基質(zhì)溶解素在細(xì)胞基質(zhì)的廣泛水解中發(fā)揮重要作用[1]。研究證實(shí)，MMP-3通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用參與關(guān)節(jié)軟骨、骨組織的侵蝕及血管翳形成過(guò)程中微血管基底膜和間質(zhì)的破壞，從而引起關(guān)節(jié)軟骨及骨組織不可逆性損傷[15]。ESR、CRP、RF是類風(fēng)濕活動(dòng)性及病程進(jìn)展的關(guān)鍵臨床指標(biāo)，在指導(dǎo)臨床用藥及相關(guān)治療中具有一定的參考作用。本研究結(jié)果顯示，RA患者血清IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP及RF水平高于健康對(duì)照組，且活動(dòng)期組高于非活動(dòng)期組(均P<0.05)；血清IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP、RF水平與RA疾病活動(dòng)性呈正相關(guān)。由此說(shuō)明，血清IL-6、IL-8、MMP-3的表達(dá)水平與RA的疾病發(fā)展演變過(guò)程密切相關(guān)，ESR、CRP、RF是臨床監(jiān)測(cè)RA活動(dòng)性及病情變化的可靠指標(biāo)。

在RA致病過(guò)程中，血清HMGB1表達(dá)水平與RA活動(dòng)性高度相關(guān)。同時(shí)，血清相關(guān)促炎因子IL-6、IL-8、MMP-3及臨床指標(biāo)ESR、CRP、RF與RA活動(dòng)性呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，RA患者HMGB1表達(dá)水平與IL-6、IL-8、MMP-3、ESR、CRP、RF均呈正相關(guān)。由此推測(cè)，血清HMGB1與促炎因子IL-6、IL-8、MMP-3具有內(nèi)在相關(guān)性，在RA病情演變過(guò)程中可能會(huì)促使滑膜慢性炎癥反應(yīng)的長(zhǎng)期持續(xù)并加重，但他們相互作用的具體機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步探究。目前，很多學(xué)者嘗試采取措施拮抗HMGB1及IL-6、IL-8、MMP-3以控制RA病情的發(fā)展及關(guān)節(jié)進(jìn)行性損傷，已取得一定進(jìn)展。隨著后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)的進(jìn)行，相信HMGB1及IL-6、IL-8、MMP-3可能成為RA治療的新靶點(diǎn)。