劉德軍，楚亞菲，李慧，趙靜

(河南省人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，鄭州 450003)

肺炎鏈球菌是一種普遍存在的傳人病原體，肺炎鏈球菌性肺炎在世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率。同時(shí)，它被認(rèn)為是社區(qū)獲得性肺炎和細(xì)菌性腦膜炎的最常見病因，也是中耳炎、鼻竇炎和支氣管炎的主要原因[1]。據(jù)估計(jì)，全世界每年有近100萬兒童死于肺炎鏈球菌感染。在疫苗使用率較高的國(guó)家， 肺炎球菌結(jié)合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine， PCV)使覆蓋地區(qū)的肺炎鏈球菌血清型相關(guān)侵襲性肺炎球菌病的發(fā)病急劇減少，并在接種肺炎鏈球菌疫苗的個(gè)體中誘導(dǎo)了顯著的群體保護(hù)[2]。然而，疫苗誘導(dǎo)的肺炎鏈球菌免疫壓力和自然遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)致了全球范圍內(nèi)的血清型替換現(xiàn)象，致使由目前使用的肺炎鏈球菌疫苗不覆蓋血清型引起的侵襲性肺炎鏈球菌病患者數(shù)迅速增加[3]。

用保守的肺炎鏈球菌表面蛋白代替多糖作為疫苗是一種很有前途的方法[4]。許多保守的肺炎鏈球菌表面蛋白在臨床前和臨床試驗(yàn)中都被研究過，比如肺炎鏈球菌膽堿結(jié)合蛋白A、基因編輯去除毒性的肺炎溶菌素、化學(xué)方法去除毒性的肺炎鏈球菌溶血素，以及肺炎鏈球菌組氨酸三聯(lián)體D和E，它們均是近年來的研究熱點(diǎn)，并被納入多組分蛋白疫苗制劑[5]。為了進(jìn)一步推進(jìn)肺炎鏈球菌蛋白疫苗的迭代和臨床效果改善，篩選出更多的疫苗候選蛋白是必要的。

錨定蛋白Z(midcell anchored protein Z， MapZ)是肺炎鏈球菌二分裂時(shí)的細(xì)胞赤道面分子信標(biāo)。肺炎鏈球菌分裂時(shí)，MapZ在細(xì)胞赤道處形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并隨著細(xì)胞拉長(zhǎng)而分開，形成分裂位點(diǎn)的永久信標(biāo)[6]。二分裂是細(xì)菌最常見的分裂方式，演變過程中細(xì)菌進(jìn)化出不同的機(jī)制以篩選分裂位點(diǎn)。MapZ和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶STK組成的系統(tǒng)是肺炎鏈球菌細(xì)胞分裂位點(diǎn)選擇和形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵靶點(diǎn)[7-8]。在肺炎鏈球菌中，Z環(huán)在分裂位點(diǎn)的定位是通過雙位膜蛋白MapZ和Ftsz間的直接相互作用介導(dǎo)的。它不僅可以標(biāo)記Ftsz的分裂位點(diǎn)和位置，還可以控制Z環(huán)閉合。MapZ的缺失會(huì)導(dǎo)致肺炎鏈球菌的二分裂障礙，影響細(xì)菌增殖[9]。同時(shí)，之前的研究表明，這種調(diào)節(jié)機(jī)制在許多種類細(xì)菌中普遍存在，且肺炎鏈球菌中的MapZ具有較高的保守性[10]。鑒于MapZ在肺炎鏈球菌分裂增殖中的關(guān)鍵作用以及其較高的保守性，其具備成為肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗的潛質(zhì)。因此，研究將驗(yàn)證皮下免疫M(jìn)apZ對(duì)感染肺炎鏈球菌小鼠的保護(hù)作用，以篩選出更有效的肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39(NCTC 7466，血清型2型)，購(gòu)自歐洲標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)中心；肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株TIGR4(血清型4型)，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；肺炎鏈球菌CMCC31436(血清型3型)、CMCC31207(血清型6B型)、CMCC31614(血清型14型)及CMCC31693(血清型19F型)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、大腸埃希菌BL21(DE3)、DH5α和pET-28a(+)載體由科室實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡健康雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(18±2) g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，共33只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的要求規(guī)范操作。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶、dNTPs、5×上樣緩沖液(含Mg2+)、DL2000 DNA marker、限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、SalⅠ、DNA小量純化試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek股份有限公司；T4 DNA連接酶、鋁佐劑，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；LPS去除試劑盒，購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；SDS-PAGE 試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA親和層析預(yù)裝柱，購(gòu)自GE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MapZ的表達(dá)純化與LPS清除 提取肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39基因組DNA；以此為模板采用正、反向引物(5′-CCCATATGAGTAAAAAAA-3′和5′-GCGTCGACGTAGTCCAAG-3′)進(jìn)行MapZ片段PCR擴(kuò)增。重組質(zhì)粒pET-28a(+)-MapZ的構(gòu)建及后續(xù)重組蛋白MapZ的表達(dá)和純化參考文獻(xiàn)[10]。使用LPS去除試劑盒清除蛋白溶液中LPS。紫外分光光度法測(cè)定純化蛋白的濃度后將樣本置于-80 ℃條件下50%甘油中保存。

1.2.2 MapZ重組蛋白抗血清的制備 免疫前于小鼠尾靜脈取血，分離血清作為陰性對(duì)照，于-20 ℃保存。每只小鼠經(jīng)皮下注射抗原(50 μg目的蛋白和50 μL 鋁佐劑)，每隔14 d加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次。末次免疫后7 d抽取小鼠心腔血，分離抗血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Western blotting分析MapZ在肺炎鏈球菌不同血清型中的同源性 肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39(2型)、CMCC31436(3型)、TIGR4(4型)、CMCC31207(6B型)、CMCC31614(14型)及CMCC31693 (19F型)全菌裂解物的制備方法參考文獻(xiàn)[11]。全菌裂解物經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜。5% BSA封閉膜載體1 h后，以MapZ特異性抗血清為一抗(1∶2 000)，羊抗鼠IgG-HRP為二抗(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育；洗膜后用ECL免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)免疫復(fù)合物的沉積情況。待顯色后通過Image Lab軟件攝片并保存，分析MapZ在肺炎鏈球菌不同血清型中的同源性，即MapZ是否在多種血清型肺炎鏈球菌中均表達(dá)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)MapZ抗血清和不同血清型肺炎鏈球菌表面原位MapZ的結(jié)合力 將肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39(2型)、CMCC31436(3型)、TIGR4(4型)、CMCC31207(6B型)、CMCC31614(14型)及CMCC31693(19F型)共6種不同血清型分別接種于30 mL C+Y培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，至細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[D(600 nm)=0.5]時(shí)收集細(xì)菌。用無菌抗原包被液將不同血清型肺炎鏈球菌(1×106CFU/孔)包被于96孔板。以目的蛋白特異性抗血清為一抗(1∶1 000)，從第1至11孔按梯度稀釋，第12孔作為空白對(duì)照；以羊抗鼠IgG-HRP為二抗(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育，顯色后于酶標(biāo)儀讀取光密度[D(540 nm)]值。根據(jù)ELISA抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，梯度稀釋后對(duì)應(yīng)空白孔2.1倍的抗體濃度即為抗體滴度。具體步驟參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.5 調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn) 自小鼠體內(nèi)分離原代腹膜巨噬細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)程序計(jì)數(shù)細(xì)胞；以DMEM重懸，均勻鋪于24孔板(5×105個(gè)/孔)，并于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h。熒光染色實(shí)驗(yàn)和菌載量實(shí)驗(yàn)具體步驟參考文獻(xiàn)[11]。調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)中使用的肺炎鏈球菌血清型為肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39(2型)。

1.2.6 抗黏附實(shí)驗(yàn) 具體步驟：(1)黏附實(shí)驗(yàn)菌載量的測(cè)定。于含10%熱滅活FCS的DMEM中培養(yǎng)A549細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)程序計(jì)數(shù)細(xì)胞并以2×105個(gè)/孔均勻鋪于24孔板。用MapZ抗血清或正常血清處理肺炎鏈球菌(2×107CFU/孔)，于37 ℃作用30 min。將該懸浮液加入A549細(xì)胞培養(yǎng)孔，于37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h。經(jīng)1 mL ddH2O裂解后，接種A549細(xì)胞于血瓊脂平板。(2)黏附實(shí)驗(yàn)熒光染色步驟。按上述條件培養(yǎng)A549細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)程序計(jì)數(shù)細(xì)胞并以2×105個(gè)/孔均勻鋪于24孔板。用MapZ抗血清或正常血清處理FITC標(biāo)記的肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39(2型)(2×107CFU/孔)，于37 ℃作用30 min。將該懸浮液加入A549細(xì)胞培養(yǎng)孔，于37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h。去除上清液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞5～10 min，PBS漂洗3次；DAPI染核5～10 min，PBS漂洗3次，封片；于熒光顯微鏡下觀察樣本激發(fā)的熒光。

1.2.7 目的蛋白皮下注射免疫C57BL/6小鼠 將C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為PBS組、MapZ組和MapZ+鋁佐劑組各11只，總共33只。每次分別皮下免疫PBS 100 μL/只、僅MapZ蛋白5.5 μg/只以及MapZ與鋁佐劑的混合物(體積比1∶1，MapZ蛋白5.5 μg/只， 鋁佐劑0.5 mg/只)。每隔2周免疫1次，共免疫3次。

1.2.8 MapZ對(duì)小鼠肺炎鏈球菌致死性肺炎模型的保護(hù)效果評(píng)估 小鼠肺炎鏈球菌致死性肺炎模型的建立： 將肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39(2型)接種于血平板，過夜培養(yǎng)，無菌PBS調(diào)整其密度至1×108CFU/20 μL；模型的建立及接種劑量的選擇參照文獻(xiàn)[11]；末次免疫2周后使用10%戊巴比妥麻醉小鼠，經(jīng)鼻滴注菌液30 μL/只，觀察記錄實(shí)驗(yàn)小鼠生存情況21 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖采用GraphPad Prism 5軟件。多組數(shù)據(jù)比較先使用方差分析，再使用Dunnett法進(jìn)行兩兩比較。對(duì)于MapZ抗血清與各肺炎鏈球菌血清型的結(jié)合能力(結(jié)合滴度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù))，該數(shù)據(jù)是“配對(duì)的”，來自同一實(shí)驗(yàn)鼠的抗原接種前后，使用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析。對(duì)于生存率，繪制Kaplan-Meier曲線并進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)以評(píng)估顯著性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 MapZ的表達(dá)純化及分析重組質(zhì)粒pET-28a(+)-MapZ經(jīng)PCR 鑒定可呈現(xiàn)特異性條帶，而pET-28a(+)空白質(zhì)粒無特異性條帶顯示(圖1A)，且重組質(zhì)粒雙向測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中編碼肺炎鏈球菌MapZ的序列一致。原核表達(dá)MapZ重組蛋白，Ni柱純化并用LPS去除試劑盒清除LPS(LPS<0.1 EU/μg)。10% SDS-PAGE分析所得蛋白，G-250染色后于相對(duì)分子質(zhì)量51 500處見目的條帶(圖1B)，相對(duì)分子質(zhì)量與MapZ相符，純度達(dá)95%以上，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用要求。

皮下免疫小鼠后，獲得MapZ抗血清，ELISA分析MapZ抗血清和肺炎鏈球菌不同血清型的結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)中選用的肺炎鏈球菌血清型包括：肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39(2型)、CMCC31436(3型)、TIGR4(4型)、CMCC31207(6B型)、CMCC31614(14型)及CMCC31693(19F型)，均為臨床常見的肺炎鏈球菌感染血清型。結(jié)果顯示，MapZ抗血清能夠和多個(gè)血清型結(jié)合，且相較于正常血清，MapZ抗血清與肺炎鏈球菌的結(jié)合能力更強(qiáng)(均P<0.05，圖1C)。為進(jìn)一步檢測(cè)MapZ抗血清的特異性，經(jīng)Western blotting分析，MapZ抗血清能特異性識(shí)別不同血清型肺炎鏈球菌表面MapZ蛋白，且條帶明顯(圖1D)。

2.2 MapZ抗血清對(duì)肺炎鏈球菌的調(diào)理吞噬作用為進(jìn)一步評(píng)價(jià)MapZ抗血清的功能，研究在細(xì)胞模型中進(jìn)行抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞計(jì)算FITC+巨噬細(xì)胞百分比(圖2A)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，相較于正常血清組，MapZ抗血清組參與肺炎鏈球菌吞噬的巨噬細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.01，圖2B)。與上述結(jié)果一致，細(xì)菌鋪板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，MapZ抗血清能夠顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎鏈球菌的吞噬能力(P<0.01，圖2C)。以上結(jié)果表明，MapZ抗血清可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎鏈球菌的吞噬能力。

2.3 MapZ抗血清對(duì)肺炎鏈球菌的黏附作用為進(jìn)一步評(píng)價(jià)MapZ抗血清的功能，研究在細(xì)胞模型中進(jìn)行抗體介導(dǎo)的抗黏附實(shí)驗(yàn)(圖3A)。通過計(jì)算黏附指數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，相較于正常血清組，MapZ抗血清能夠顯著減少肺炎鏈球菌對(duì)A549的黏附(P<0.01，圖3B)。與上述結(jié)果一致，細(xì)菌鋪板計(jì)數(shù)示MapZ抗血清組A549細(xì)胞表面黏附的細(xì)菌數(shù)顯著減少(P<0.05，P<0.01，圖3C)。以上結(jié)果表明，MapZ抗血清能顯著抑制肺炎鏈球菌對(duì)A549的黏附。

2.4 免疫M(jìn)apZ對(duì)肺炎鏈球菌致死性肺炎模型保護(hù)效果的評(píng)估末次免疫2周后，用肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39(2型)鼻腔攻毒各組小鼠，連續(xù)監(jiān)測(cè)21 d小鼠的生存情況。結(jié)果顯示，MapZ +鋁佐劑免疫組小鼠的半數(shù)生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于MapZ單獨(dú)免疫組以及PBS對(duì)照組(P<0.05，P<0.01，圖4)。

注：A.MapZ重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定，M為DL2000 DNA marker，1為pET-28a(+)-MapZ，2為pET-28a(+)空白質(zhì)粒；B. 原核表達(dá)MapZ的SDS-PAGE分析，M為DL2000 DNA marker，1為MapZ蛋白；C.MapZ抗血清和不同血清型肺炎鏈球菌表面原位MapZ的結(jié)合能力；D.Western blotting分析MapZ蛋白結(jié)合抗血清的特異性。與正常血清組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 MapZ的表達(dá)純化及分析

注：A.MapZ抗血清介導(dǎo)的調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)熒光圖(×40)；B.FITC+巨噬細(xì)胞百分比；C.調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)菌載量。**P<0.01。圖2 MapZ抗血清對(duì)肺炎鏈球菌調(diào)理吞噬作用的影響

注：*P<0.05， **P<0.01。圖4 MapZ對(duì)肺炎鏈球菌致死性肺炎模型保護(hù)效果的評(píng)估

3 討論

肺炎鏈球菌正常定位于人體鼻咽部，但其有90多種血清型，臨床常見的有30多種，能導(dǎo)致侵襲性感染如肺炎、腦膜炎和敗血癥[12-13]。該研究旨在探究MapZ作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗的潛質(zhì)。

研究制備的是MapZ蛋白全長(zhǎng)，而不僅僅是胞外部分。為驗(yàn)證MapZ在不同血清型中的同源性，選擇了侵襲能力較強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株 D39 和在中國(guó)普遍流行的CMCC31436(3型)、CMCC31207(6B型)、CMCC31614(14型)及CMCC31693(19F型)等臨床分離菌株[14]。Western blotting和ELISA結(jié)果顯示，MapZ抗血清能夠特異性識(shí)別不同血清型肺炎鏈球菌中MapZ蛋白，并具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證抗血清的功能，使用原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞建立調(diào)理吞噬及抗黏附實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并用免疫熒光和菌載量2種方法評(píng)價(jià)MapZ抗血清的調(diào)理吞噬能力。結(jié)果提示，MapZ抗血清具有調(diào)理吞噬作用，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎鏈球菌的吞噬。在抗黏附細(xì)胞模型中，MapZ抗血清能夠顯著抑制肺炎鏈球菌與A549細(xì)胞的黏附。

鋁佐劑是人體疫苗接種中使用的主要佐劑[15]，因此研究選擇明礬作為佐劑以驗(yàn)證MapZ皮下免疫小鼠后抗血清對(duì)肺炎鏈球菌感染模型的作用。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D39致死性劑量鼻腔攻毒后，重組蛋白加鋁佐劑可顯著延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠存活時(shí)間。

該研究對(duì)MapZ進(jìn)行了多方面的評(píng)估，驗(yàn)證了其在不同血清型肺炎鏈球菌中的同源性。同時(shí)，MapZ抗血清具有調(diào)理吞噬作用和抗肺炎鏈球菌黏附能力。MapZ和鋁佐劑能夠有效提高肺炎鏈球菌鼻腔致死性攻毒后小鼠模型的生存率，這充分證明了MapZ是一種具有潛力的肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗。