趙曙光，高偉年，于丁，陳子英

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 心外科，石家莊 050000)

髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC； CD11b+Gr-1+Ly6C+F4/80intCD115+)是不完全分化的未成熟骨髓(bone marrow，BM)細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞(myeloid progenitor cell，MPC)的罕見異質(zhì)群體[1]。它們在炎癥環(huán)境下可從MPC擴(kuò)增而來[2]，具有抑制T細(xì)胞增殖的能力[3]。許多因素可調(diào)控MDSC分化，諸因素導(dǎo)致的髓系祖細(xì)胞(common myeloid progenitor cell，CMPC) 發(fā)育分化異常會生成MDSC[4]。目前文獻(xiàn)可考的誘導(dǎo)MDSC生成的方案多基于GM-CSF、G-CSF、IL-1β、IL-6、LPS等因子的不同組合，IL-6等炎性因子發(fā)揮了重要作用[5]。體外研究發(fā)現(xiàn)，直接抑制T細(xì)胞組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)從而增加組蛋白H3賴氨酸乙?；?，可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3轉(zhuǎn)錄，使T細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制活性[6]，因此，HDAC是重要的細(xì)胞表觀遺傳輔助調(diào)節(jié)因子，并經(jīng)典地調(diào)節(jié)基因表達(dá)。已經(jīng)證明，單獨(dú)應(yīng)用HDAC抑制劑可抑制DC分化[7-8]并降低這些抗原提呈細(xì)胞的刺激能力[9]，減少這些細(xì)胞的MHC基因產(chǎn)物、共刺激分子和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。鑒于HDAC抑制劑具有調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及炎性基因表達(dá)的能力，本研究假設(shè)廣譜HDAC抑制劑曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)能夠阻止未成熟BM細(xì)胞分化為成熟BM細(xì)胞，同時應(yīng)用大劑量GM-CSF使造血細(xì)胞向髓樣偏移[11]，從而進(jìn)一步體外收獲BM細(xì)胞來源的MDSC。雖然MDSC是腫瘤生長的“幫兇”[12]，但鑒于其具有抑制移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)和介導(dǎo)實驗性移植耐受的能力[13]，已成為繼Treg后又一個被公認(rèn)的抑制移植排斥的細(xì)胞治療劑[14]。本研究將進(jìn)一步考察體外獲取的MDSC對異基因效應(yīng)T細(xì)胞的抑制效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料8～12周齡的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級C57BL/6 及BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由北京維通利華實驗動物公司提供，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)動物中心層流房，動物飼料及輔料經(jīng)60Co輻射處理，飲用水為潔凈級。重組小鼠GM-CSF(recombinant mouse GM-CSF，rmGM-CSF)、抗CD11b-FITC、抗Gr-1-別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)及同型對照抗體購自BD公司，TSA購自Sigma公司，小鼠Treg分選試劑盒、雞尾酒抗體-FITC、抗CD25-藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、MS及LS分選柱、抗熒光磁珠購自Miltenyi Biotec公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、FCS、Ficoll購自Gibco公司，小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒購自晶美公司，MTT購自Sigma公司。FACScalibur E2943型FCM購自BD公司，Multiskom MK3型酶標(biāo)儀購自雷勃公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BM細(xì)胞及脾臟單個核細(xì)胞的制備 采用頸部脫臼法處死C57BL/6小鼠，用乙醇浸泡消毒，摘取小鼠股骨及脛骨，用無菌紗布擦刮附著在骨頭上的殘余肌肉，用生理鹽水將骨髓腔中的BM沖洗至40 μm濾網(wǎng)上，研磨后獲得BM細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液置培養(yǎng)箱12 h，取懸浮BM細(xì)胞以備培養(yǎng)。摘取小鼠脾臟，剪碎后于40 μm濾網(wǎng)上研磨，獲得脾臟單個核細(xì)胞懸液。

1.2.2 TSA與rmGM-CSF聯(lián)合對BM細(xì)胞的體外誘導(dǎo) 應(yīng)用抗CD11b-FITC、抗Gr-1-APC標(biāo)記BM細(xì)胞，使用FCM檢測抗原表達(dá)情況。將BM細(xì)胞分為3組，分別采用TSA、rmGM-CSF、TSA+rmGM-CSF培養(yǎng)， 在第2、4和6天向培養(yǎng)物中加入rmGM-CSF(1 000 U / mL)及TSA(1 nmol/L)，第7天收獲細(xì)胞并再次用FCM檢測CD11b、Gr-1抗原表達(dá)情況。

1.2.3 各組BM細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6水平的ELISA檢測 培養(yǎng)BM細(xì)胞第7天，將細(xì)胞培養(yǎng)液離心并取上清液，設(shè)空白孔，依據(jù)試劑盒要求依次加入樣品，封板，37 ℃溫育30 min，棄去液體，甩干，加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次。每孔加入酶標(biāo)試劑 50 μL(空白孔除外)，溫育后再次洗滌，每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，依次測量各孔的光密度[D(450 nm)]值。

1.2.4 小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25-T細(xì)胞及CD4+CD25+Treg的磁珠分選 應(yīng)用雞尾酒抗體-PE 4 ℃避光標(biāo)記PBMC 10 min(10 μL含107個細(xì)胞)，經(jīng)緩沖液洗滌2次后加入抗PE磁珠，LS柱陰選細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞。將抗CD25-FITC加入CD4+T細(xì)胞標(biāo)記10 min(10 μL含107個細(xì)胞)，緩沖液洗滌2次，加入抗FITC磁珠，經(jīng)MS柱分選獲取CD4+CD25-T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞。應(yīng)用PE-Gr-1mAb標(biāo)記體外培養(yǎng)后的BM細(xì)胞10 min(10 μL含107個細(xì)胞)，經(jīng)緩沖液洗滌2次后加入抗PE磁珠，LS柱陽選細(xì)胞為Gr1+細(xì)胞。用以上方法分別獲取C57BL/6小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25+Treg及BALB/c小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞以備進(jìn)一步檢測。

1.2.5 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 用RPMI 1640普通培養(yǎng)液調(diào)整各組細(xì)胞數(shù)為1×106個/mL，分別設(shè)定C57BL/6小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25+Treg為抑制細(xì)胞S1和S2，BALB/c小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞為應(yīng)答細(xì)胞R。設(shè)置CD4+CD25-T細(xì)胞對照組及S1+R(1∶1)、S2+R(1∶1)混合組。各組均加入經(jīng)絲裂霉素滅活的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞(2×105個/mL)。各組混合細(xì)胞放置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育68 h，觀察細(xì)胞的增殖能力。離心后置于含MTT溶液(10 μL/孔)的培養(yǎng)液中4 h，加入鹽酸-異丙醇，用酶標(biāo)儀檢測D(570 nm)值。

2 結(jié)果

2.1 各組誘導(dǎo)培養(yǎng)BM細(xì)胞分化及MDSC相關(guān)抗原的表達(dá)天然BM細(xì)胞作為MDSC生成的前體細(xì)胞群，在缺乏外界細(xì)胞因子刺激的情況下，細(xì)胞群MDSC相關(guān)標(biāo)志物Gr-1、CD11-b表達(dá)較弱。單獨(dú)應(yīng)用TSA對BM細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，TSA并不能促進(jìn)BM細(xì)胞的分裂增殖，且對BM細(xì)胞的分化具有抑制作用，而單獨(dú)應(yīng)用rmGM-CSF可誘導(dǎo)BM細(xì)胞向單核粒系細(xì)胞偏移，且3 d后細(xì)胞增殖明顯加快，第5天細(xì)胞分化明顯，出現(xiàn)普遍貼壁現(xiàn)象。在TSA聯(lián)合應(yīng)用rmGM-CSF的情況下，BM細(xì)胞增殖快于單獨(dú)應(yīng)用TSA。在培養(yǎng)第7天，檢測各組細(xì)胞的MDSC相關(guān)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，TSA組出現(xiàn)CD11b+Gr-1+細(xì)胞，但細(xì)胞分散且收獲數(shù)量較少；rmGM-CSF組CD11b+Gr-1+細(xì)胞含量低；TSA+rmGM-CSF組可誘導(dǎo)出CD11b+Gr-1+細(xì)胞群，雙陽性細(xì)胞約占59.7%，因此認(rèn)為，所收獲的細(xì)胞為富含MDSC的細(xì)胞群。(圖1、圖2)

注：A.天然BM細(xì)胞；B.單獨(dú)應(yīng)用TSA誘導(dǎo)培養(yǎng)BM細(xì)胞7 d；C.單獨(dú)應(yīng)用rmGM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)BM細(xì)胞7 d；D.TSA+rmGM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)BM細(xì)胞7 d。圖1 各組BM細(xì)胞CD11b、Gr-1的FACS檢測

注：A.天然BM細(xì)胞；B.單獨(dú)應(yīng)用TSA誘導(dǎo)培養(yǎng)BM細(xì)胞7 d；C.單獨(dú)應(yīng)用rmGM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)BM細(xì)胞7 d；D.TSA+rmGM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)BM細(xì)胞7 d。圖2 各組BM細(xì)胞的分化發(fā)育(10×40)

2.2 BM細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6水平的檢測培養(yǎng)BM細(xì)胞第7天，將各組細(xì)胞培養(yǎng)液離心并取上清液，使用ELISA檢測IL-6水平。結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用rmGM-CSF刺激分化的BM細(xì)胞IL-6分泌水平較少[(96±8)pg/mL]，應(yīng)用TSA刺激分化的BM細(xì)胞IL-6分泌水平增加[(232±11)pg/mL]，而TSA+rmGM-CSF刺激分化的BM細(xì)胞，其培養(yǎng)液中含有較高水平的IL-6[(514±47)pg/mL]，rmGM-CSF組及TSA+rmGM-CSF組培養(yǎng)液中IL-6水平較單獨(dú)應(yīng)用TSA組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。(圖3)

注：與TSA組比較，*P<0.05。圖3 ELISA檢測各組細(xì)胞第7天培養(yǎng)液中IL-6水平

2.3 磁珠分選Gr-1+BM細(xì)胞、CD4+CD25-T細(xì)胞及CD4+CD25+Treg應(yīng)用TSA聯(lián)合rmGM-CSF培養(yǎng)的天然BM細(xì)胞分化為具有Gr-1及CD11b高表達(dá)的細(xì)胞群體，應(yīng)用抗Gr-1-FITC標(biāo)記細(xì)胞群，采用磁珠陽選進(jìn)一步提高M(jìn)DSC純度，獲得陽性率為93.8%的CD11b+Gr-1+細(xì)胞(圖4A)，將該細(xì)胞群視為純度較高的MDSC，同樣采用磁珠分選獲取CD4+CD25-T細(xì)胞(圖4B)及CD4+CD25+Treg(圖4C)，將以上3組細(xì)胞用于混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。

2.4 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，對照組CD4+CD25-T細(xì)胞在培養(yǎng)68 h后呈現(xiàn)較強(qiáng)的增殖能力，而當(dāng)MDSC、CD4+CD25+Treg分別與CD4+CD25-T細(xì)胞混合培養(yǎng)(S1+R、S2+R)后CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖能力均被有效抑制。研究證實，經(jīng)磁珠分選獲得的MDSC具有較強(qiáng)的抑制T細(xì)胞增殖的能力，然而該MDSC對異基因效應(yīng)T細(xì)胞的免疫抑制能力弱于Treg。(圖5)

注：與S1+R組比較， *P<0.05。圖5 MTT法檢測各組混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖情況

3 討論

到目前為止，特異性調(diào)控MDSC分化的因素尚未被發(fā)現(xiàn)[5]，現(xiàn)有的諸多體外誘導(dǎo)制備方案均為細(xì)胞因子及生長因子的組合，誘導(dǎo)分化效率低下，無法滿足細(xì)胞治療的應(yīng)用[15]。本研究采用外源性HDAC抑制劑參與誘導(dǎo)MDSC形成，其高效的細(xì)胞誘導(dǎo)及擴(kuò)增體系的建立將推進(jìn)MDSC的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。

本研究從小鼠BM中獲取天然BM細(xì)胞，在體外直接采用HDAC抑制劑(TSA)培養(yǎng)BM細(xì)胞，以影響CMPC的正常分化發(fā)育，同時聯(lián)合大劑量的rmGM-CSF誘導(dǎo)BM細(xì)胞向髓系細(xì)胞偏移，來獲取更多的MDSC。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，BM細(xì)胞在rmGM-CSF方案下3～5 d均有明顯增殖，而在TSA組，細(xì)胞分化成熟受到抑制，細(xì)胞增殖不明顯。在BM細(xì)胞培養(yǎng)的第7天，rmGM-CSF組細(xì)胞明顯貼壁，而TSA組貼壁不明顯。因此，認(rèn)為TSA主要抑制了BM細(xì)胞的正常分化發(fā)育，而rmGM-CSF則促進(jìn)了BM細(xì)胞向單核粒系細(xì)胞的分化和增殖，當(dāng)用TSA+rmGM-CSF刺激培養(yǎng)BM細(xì)胞時，最終收獲的應(yīng)以單核系MDSC為主。

有文獻(xiàn)報道，鼠MDSC共表達(dá)CD11b和Gr-1，分別占正常鼠BM細(xì)胞和脾細(xì)胞群體的20%～30%和2%～4%[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠天然BM細(xì)胞低表達(dá)CD11b和Gr-1，認(rèn)為小鼠BM在非炎性及非腫瘤環(huán)境中不是形成MDSC的“土壤”。在應(yīng)用TSA及TSA+rmGM-CSF方案誘導(dǎo)BM細(xì)胞7 d后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)細(xì)胞Gr-1、CD11b表達(dá)明顯增強(qiáng)，雖然TSA作用于BM細(xì)胞的詳細(xì)機(jī)制尚未闡明，但可初步推斷組蛋白乙?；饕l(fā)生在H3、H4的N端比較保守的賴氨酸位置上，H3、H4的乙?；纱蜷_一個開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加特定基因的表達(dá)[7]，推測HDAC抑制劑作為細(xì)胞表觀遺傳輔助調(diào)節(jié)因子，可能調(diào)控了BM細(xì)胞與分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的水平，進(jìn)而影響了相關(guān)基因的表達(dá)，從而阻斷了BM細(xì)胞分化為成熟的BM細(xì)胞。本研究也證實，TSA可以誘導(dǎo)BM細(xì)胞炎性因子IL-6的分泌。進(jìn)一步用磁珠分選的Gr-1+細(xì)胞純化MDSC，經(jīng)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實驗證實，Gr-1+細(xì)胞可以有效抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的活化增殖，應(yīng)用TSA 聯(lián)合rmGM-CSF方案可以誘導(dǎo)BM細(xì)胞向MDSC分化。

綜上所述，TSA聯(lián)合大劑量rmGM-CSF可以在體外誘導(dǎo)BM細(xì)胞高表達(dá)Gr-1、CD11b，誘導(dǎo)出的MDSC呈現(xiàn)較強(qiáng)的免疫抑制活性，具有較高的細(xì)胞治療應(yīng)用價值。目前已知，C/EBP、PU.1及STAT家族轉(zhuǎn)錄因子可以非特異性地調(diào)控MDSC生成[17]，HDAC是重要的表觀遺傳輔助調(diào)節(jié)因子，組蛋白乙?；峁┝司_的調(diào)控機(jī)制，但只有其中一小部分基因受HDAC調(diào)控抑制[18]。胞內(nèi)組蛋白乙?；{(diào)控如何影響免疫抑制類細(xì)胞的分化尚需進(jìn)一步闡明。