翁史昱，周靜，麥成華，張申平

上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院（上海 200233）

共軛亞油酸（CLA）是亞油酸異構(gòu)體混合物的總稱，其共軛雙鍵以順式或反式結(jié)構(gòu)存在，目前發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)體有20種。2009年原衛(wèi)生部第12號(hào)公告批準(zhǔn)共軛亞油酸和共軛亞油酸甘油三酯為新資源食品，共軛亞油酸系列產(chǎn)品越來越受到人們的關(guān)注，關(guān)于其功能特性、應(yīng)用和分析方法的研究也不斷深入。研究發(fā)現(xiàn)CLA是一種無毒、無遺傳突變的可食用性油脂，被譽(yù)為“21世紀(jì)綠色營養(yǎng)保健品”[1]。其具有抗動(dòng)脈硬化[2]、減肥降脂[3-4]、抗癌[5]、抗炎[6-7]等生理功能，具有生物活性的異構(gòu)體主要以9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的形式存在[8-10]。

共軛亞油酸廣泛分布在許多食品中，天然CLA主要存在于瘤胃動(dòng)物牛、羊等的乳及肉制品脂肪中。牛奶是最豐富的天然CLA來源，平均每克牛奶的脂肪中CLA含量在2～37 mg之間[11]。針對(duì)共軛亞油酸采用的主要分析方法有氣相色譜法[12-17]、高效液相色譜法[18-20]、紫外光譜法[21]和氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）[22]等，或者幾種方法一起使用，達(dá)到對(duì)共軛亞油酸異構(gòu)體的分離和鑒別目的。氣相色譜（GC）法是傳統(tǒng)分析脂肪酸的方法，具有快速、高效、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，其分析結(jié)果準(zhǔn)確度較高，穩(wěn)定性好，國家和國際標(biāo)準(zhǔn)中都有方法規(guī)定[23-24]。通過GC分析CLA的研究報(bào)道已有不少，涉及牛乳制品[11-12,14]、驢乳[21]、牛羊乳脂[15,25]、牛肉[13]和芝麻[19]等中的含量檢測，然而現(xiàn)階段研究缺乏應(yīng)用GC-FID法測定保健食品中CLA的研究，并且國標(biāo)中尚未見保健食品中CLA的檢測標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)針對(duì)保健食品中兩種主要異構(gòu)體9-cis, 11-trans CLA和10-trans,12-cis CLA的分析方法進(jìn)行研究，建立2種異構(gòu)體的準(zhǔn)確、靈敏的定量分析方法，滿足實(shí)際檢測需求，為該領(lǐng)域的研究提供基礎(chǔ)。

圖1 共軛亞油酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 7890A氣相色譜質(zhì)譜儀（配有氫火焰離子化檢測器，美國Agilent公司）；SIGMA 3K30離心機(jī)（德國Sigma公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；SK8210LHC超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；萬分位分析天平（美國DENVER公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；N-EVAPTM 111型吹氮濃縮儀（美國Organomation公司）。

9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（美國Nu-Chek公司）；十一碳酸甘油三酯（美國Sigma公司）。

甲醇、甲苯（色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙酰氯、無水碳酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

共軛亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品各200 mg置于20 mL容量瓶內(nèi)，用甲苯定容混勻后制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。

內(nèi)標(biāo)（十一碳酸甘油三酯）儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取100 mg十一碳酸甘油三酯置于100 mL容量瓶內(nèi)，用甲苯混勻定容后，于4 ℃保存。

共軛亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取0.10，0.25，0.50，1.00和2.50 mL共軛亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于15 mL螺口玻璃管中，每個(gè)管中加入0.10 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。分別加入一定量甲苯定容至5.0 mL。得到共軛亞油酸甲酯質(zhì)量濃度分別為200，500，1 000，2 000和5 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

乙酰氯-甲醇溶液（乙酰氯體積分?jǐn)?shù)10%）：量取40 mL甲醇于100 mL干燥的燒杯中，準(zhǔn)確吸取5.0 mL乙酰氯逐滴緩慢加入，不斷攪拌，冷卻后轉(zhuǎn)移并定容至50 mL干燥的容量瓶中。臨用前配制（乙酰氯為刺激性試劑，配制乙酰氯甲醇溶液時(shí)應(yīng)不斷攪拌防止噴濺，注意防護(hù)）。

碳酸鈉溶液（6%）：準(zhǔn)確稱取6 g 無水碳酸鈉于100 mL燒杯中，加水溶解，轉(zhuǎn)移并用水定容至100 mL容量瓶中。

1.2.2 樣品前處理

稱取0.5 g樣品（精確至0.1 mg），加入0.1 mL內(nèi)標(biāo)液置于15 mL螺口玻璃管中，在玻璃管中加入5 mL甲苯，加入6 mL 10%乙酰氯甲醇溶液，旋緊螺旋蓋，置于80 ℃烘箱中加熱2 h，取出冷卻至室溫。將反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，分別用3.0 mL 6%碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸鈉溶液于50 mL離心管中，混勻，以5 000 r/min離心約3 min。取上清液作為試液，氣相色譜儀測定。

1.2.3 儀器條件

氣相色譜儀具有氫火焰離子化檢測器（FID）；色譜柱為Supelco SP-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm）石英毛細(xì)管柱；載氣為氮?dú)?，流?.0 mL/min；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比30∶1；進(jìn)樣口溫度220 ℃；進(jìn)樣量0.2 μL；FID檢測器溫度300 ℃；燃燒室氣體為氫氣（40 mL/min）、空氣（400 mL/min）；程序升溫為100 ℃保持2 min，以5 ℃/min程序升溫至210 ℃，以2 ℃/min升溫至240 ℃，保持6 min，以10 ℃/min升溫至245 ℃，保持9 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件優(yōu)化

由于CLA不穩(wěn)定，很易轉(zhuǎn)變成其他異構(gòu)體，所以在測定前必須對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化處理。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.168《食品中脂肪酸的測定》中涉及不同食品樣品中脂肪酸甲酯化的方法通常有三氟化硼法、三甲基氫氧化硫法、酯交換法和乙酰氯-甲醇甲酯化方法[26]。這4種方法甲酯化效率不一，適用樣品范圍也不同。酸催化甲酯化方法在酯化過程中易產(chǎn)生其他異構(gòu)體和含甲氧基反應(yīng)產(chǎn)物，這些產(chǎn)物影響脂肪酸的分析，因此不太適合脂肪酸甲酯的制備；此外，升高溫度及酯化反應(yīng)時(shí)間也影響甲酯化產(chǎn)物。結(jié)果表明，相對(duì)其他幾種方法，10%乙酰氯-甲醇法對(duì)于粉末狀保健食品中的共軛亞油酸具有更好甲酯化效率。

在分析共軛亞油酸時(shí)，順，反構(gòu)型的共軛亞油酸異構(gòu)體9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯在脂肪酸常規(guī)分析的Carbowax類型的固定相色譜柱上都可以分開，但其他的脂肪酸（C18∶1N9c和C18∶1N9T）會(huì)在60 m色譜柱上與這2個(gè)峰相重疊。為了得到更好分離效果，必須使用極性更強(qiáng)、柱長更長的毛細(xì)管柱[11]。該方法采用SP-2560這一極性非常強(qiáng)的脂肪酸甲酯測定專用毛細(xì)管柱分離、測定共軛亞油酸異構(gòu)體，在實(shí)際粉末狀保健食品測定的研究得到應(yīng)用，說明所建立的試驗(yàn)條件準(zhǔn)確可靠。

2.2 方法的線性范圍及檢出限

測定5個(gè)系列濃度的共軛亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以內(nèi)標(biāo)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。以目標(biāo)化合物峰面積/內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。共軛亞油酸的具體標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

從表1看，在相同的檢測條件下，9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度在200～5 000 mg/L時(shí)，線性相關(guān)系數(shù)r2均為0.999，能滿足檢測要求。

以被測物質(zhì)的信噪比S/N≥3時(shí)的進(jìn)樣濃度定為檢出限（LOD），S/N≥10時(shí)的進(jìn)樣濃度為定量限（LOQ）。在取樣量0.5 g、定容體積5.0 mL前處理?xiàng)l件下，試驗(yàn)方法對(duì)9-cis, 11-trans CLA甲酯的定性檢出限為0.594 g/100 g；定量檢出限為1.98 g/100 g；對(duì)10-trans, 12-cis CLA甲酯的定性檢出限為0.707 g/100 g；定量檢出限為2.36 g/100 g。按照0.952 4的折算系數(shù)，折算9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的定量檢出限，分別為1.89和2.25 g/100 g。

表1 共軛亞油酸甲酯的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限

2.3 回收率及精密度試驗(yàn)

以1份保健食品為樣品，在9，18和36 g/100 g 3個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。

參照GB/T 27417—2017附錄A～C對(duì)于檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求，方法的回收率與精密度滿足檢測的要求。

表2 共軛亞油酸的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4 實(shí)際樣品測定

圖2 典型陽性樣品的目標(biāo)物色譜圖

用該方法對(duì)2份粉末狀保健食品中9-cis, 11-trans亞油酸和10-trans, 12-cis亞油酸進(jìn)行檢測，樣品檢出譜圖見圖2。具體檢測結(jié)果顯示，2份保健食品中的9-cis, 11-trans亞油酸分別為8.474和8.444 g/100 g；而10-trans, 12-cis亞油酸為8.825和8.804 g/100 g。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化衍生溶液體系，粉末狀保健食品基質(zhì)中2種共軛亞油酸物質(zhì)的回收率得到有效提高，通過簡化前處理步驟，優(yōu)化色譜分離程序，建立回收率高、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的保健食品中9-cis, 11-trans亞油酸和10-trans, 12-cis亞油酸的分析方法。該方法經(jīng)實(shí)際樣品檢測證實(shí)，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，適合日常實(shí)驗(yàn)室批量測定保健食品中的共軛亞油酸。