李碧波，杜鵬程，裴娟娟

仙桃市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心（仙桃 433000）

豆芽是日常生活中常見(jiàn)的蔬菜，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，甚至還能治療一些常見(jiàn)病，有良好藥用價(jià)值[1-3]，深受人們喜愛(ài)。然而，一些豆芽的無(wú)良商家為達(dá)到高產(chǎn)量、高質(zhì)量目的，生產(chǎn)過(guò)程中濫用各種違禁藥物，主要包括4-CPA-Na和6-BA等，對(duì)人體健康造成惡劣影響。根據(jù)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局食品安全抽檢公布結(jié)果查詢系統(tǒng)不完全統(tǒng)計(jì)，自2014年—2020年3月底，站內(nèi)統(tǒng)計(jì)抽檢黃豆芽近7 500批次，綠豆芽近7 800批次，豆芽近4 100批次，總計(jì)約2萬(wàn)批次。其中，不合格批次超過(guò)2 100批次，約占總數(shù)的10.8%，且不合格項(xiàng)主要涉及4-CPA-Na和6-BA，在食品安全監(jiān)管領(lǐng)域是一個(gè)突出問(wèn)題難題。

關(guān)于豆芽中的檢測(cè)方法主要以液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法為主，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)檢測(cè)方法[4-8]均采用不同方法對(duì)單一組分分別檢測(cè)，工作量大，難以滿足實(shí)際的檢測(cè)需要。同時(shí)測(cè)定的方法也有很多[9-11]，但在豆芽樣品的前處理過(guò)程中均涉及固相萃取小柱凈化或氮吹濃縮，使得前處理過(guò)程極其復(fù)雜繁瑣，降低檢測(cè)效率的同時(shí)，也增加污染風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)優(yōu)化提取方法和凈化環(huán)節(jié)，只需將樣品提取、純化、稀釋即可進(jìn)樣，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀高靈敏度特性，建立便捷高效的豆芽中4-CPA-Na和6-BA的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Ultimate 3000液相串聯(lián)TSQ Quantum Access Max質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific，配有格林威爾氮?dú)獍l(fā)生器）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL16M，湘立科學(xué)儀器有限公司）；渦旋混合器（Vortex 3000，Wiggens）；組織搗碎機(jī)（博朗食品加工機(jī)FP 3010，Braun）；電子分析天平（MS205DU，瑞士Mettler-Toledo公司）；超聲清洗機(jī)（410HT，深圳潔拓科技）。

4-氯苯氧乙酸鈉（4-CPA-Na，標(biāo)準(zhǔn)品250 mg，純度≥99.0%，CAS NO 13730-98-80，美國(guó)阿爾塔）；6-芐基腺嘌呤（6-BA，標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.38%，CAS NO 1214-39-7，Stanford chemicals）；甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；C18粉末（博納艾杰爾科技有限公司）；其他試劑（均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；PCX小柱（艾杰爾混合陽(yáng)離子交換小柱）。

豆芽樣品（流通環(huán)節(jié)監(jiān)督抽檢樣品）。

1.2 樣品前處理

取適量豆芽樣品用博朗食品加工機(jī)粉碎均勻后封存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取10.000 g處理好的豆芽樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 5%乙酸乙腈，振搖1 min，超聲5 min，加入氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂各1.0 g，渦旋振蕩2 min，8 000 r/min離心5 min，恢復(fù)室溫后，吸取5 mL上清液于15 mL離心管中，加入150 mg C18粉末，渦旋振蕩，以8 000 r/min離心5 min，恢復(fù)室溫后，吸取100 μL上清液，用空白基質(zhì)提取液定容至1 mL，渦旋振蕩1 min，過(guò)0.22 μm針式過(guò)濾膜，供LCMS/MS分析。

同時(shí)選取不含4-CPA-Na、6-BA的豆芽樣品，按上述處理方法制備空白基質(zhì)提取液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

4-CPA-Na、6-BA標(biāo)準(zhǔn)品用十萬(wàn)分之一天平分別準(zhǔn)確稱取0.100 0 g；用合適溶劑溶解，甲醇定容；配制成4-CPA-Na、6-BA含量1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。甲醇稀釋成100.0 ng/mL中間濃度作為混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。分別準(zhǔn)確吸取一定體積混合標(biāo)準(zhǔn)使用液于進(jìn)樣瓶中，加空白基質(zhì)提取液定容至1 mL，臨用時(shí)現(xiàn)配；配制成質(zhì)量濃度依次為0.1，0.5，1.0，2.0，5.0和20.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.4 儀器分析條件

液相色譜參數(shù)：色譜柱，賽默飛原裝Hypersil GOLD? C18（3 μm，150 mm×2.1 mm）；流動(dòng)相A，5 mmol乙酸銨溶液；流動(dòng)相B，乙腈；流動(dòng)相流速0.30 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL。柱溫35 ℃。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜各項(xiàng)性能參數(shù)見(jiàn)表2，目標(biāo)化合物的SRM條件見(jiàn)表3。

表2 質(zhì)譜參數(shù)條件

表3 4-CPA-Na和6-BA的SRM條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

4-CPA-Na易溶于水、酸化甲醇和酸化乙腈；6-BA在甲醇和乙腈中的溶解度較高，難溶于水，但降低水系提取液中pH時(shí)，6-BA能達(dá)到穩(wěn)定的溶解度；因此試驗(yàn)考察分別用0.1 mol/L鹽酸、甲醇、乙腈作為提取液時(shí)4-CPA-Na和6-BA的加標(biāo)回收率，同一濃度重復(fù)測(cè)定5次，加標(biāo)回收率見(jiàn)表3。結(jié)果表明，3種提取溶劑都能兼顧4-CPA-Na和6-BA的加標(biāo)回收率。以0.1 mol/L鹽酸作提取液時(shí)，因強(qiáng)酸溶液不能直接進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器，需使用PCX小柱固相萃取吸附、洗脫以置換溶劑，該過(guò)程可能造成目標(biāo)化合物的丟失，致使回收率稍低，且使用固相萃取小柱會(huì)提高檢測(cè)成本，樣品凈化過(guò)程耗時(shí)更長(zhǎng)。使用甲醇和乙腈作提取液時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙腈作提取液時(shí)的目標(biāo)化合物的峰型要更尖銳對(duì)稱，原因可能是豆芽中的蛋白含量及脂類含量要高于一般蔬菜，使用乙腈提取時(shí)能沉淀蛋白振蕩從而降低基質(zhì)干擾。綜合考量，選用乙酸乙腈作為4-CPA-Na和6-BA的提取溶劑。超聲提取后加入氯化鈉，無(wú)水硫酸鎂使水相和樣品中水分和乙腈分層，離心后取上清液加入C18粉末凈化，能達(dá)到理想的提取凈化效果。根據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)及其消除方法[12]中傳統(tǒng)消除基質(zhì)效應(yīng)的方法，進(jìn)樣前將樣品稀釋能減少本底進(jìn)樣量達(dá)到進(jìn)一步降低基質(zhì)效應(yīng)的目的。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將4-CPA-Na和6-BA含量100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液通過(guò)注射泵直接進(jìn)入質(zhì)譜，進(jìn)行正負(fù)離子全掃描，通過(guò)調(diào)整鞘氣流速、輔助氣流速、霧化溫度等使目標(biāo)化合物的母離子m/z得到最優(yōu)響應(yīng)值。

4-CPA-Na在負(fù)離子模式下響應(yīng)值穩(wěn)定，采用負(fù)離子掃描模式；6-BA可產(chǎn)生[M+H]+離子峰m/z226，也可產(chǎn)生[M-H]-離子峰m/z224，正負(fù)離子掃描均有響應(yīng)，同一濃度時(shí)離子峰m/z226響應(yīng)值優(yōu)于m/z224，見(jiàn)圖1和圖2；6-BA在正離子掃描模式下靈敏度更高，應(yīng)選用離子峰m/z226。選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式，自動(dòng)優(yōu)化Tube Lens、碰撞能量，得到幾對(duì)不同的離子對(duì)，選取184.98＞127.0，184.98＞141.10作為4-CPANa定量、定性離子，226.07＞91.2，226.07＞65.3作為6-BA定量、定性離子。

表4 不同提取溶劑4-CPA-Na和6-BA回收率

圖1 6-BA負(fù)離子模式下的母離子圖

圖2 6-BA正離子模式下的母離子圖

2.3 色譜條件的優(yōu)化

優(yōu)化色譜條件需要考慮色譜峰的峰型、分離效果及保留效果等參數(shù)的影響，色譜柱及流動(dòng)相的選擇起關(guān)鍵性的作用。通過(guò)比較Hypersil GOLD? C18（3 μm，2.1 mm）色譜柱150 mm和100 mm 2款，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 mm色譜柱在保留效果、分離效果上較低，目標(biāo)化合物出峰快，與樣品中存在的雜質(zhì)未有效分離，會(huì)降低電噴霧接口處4-CPA-Na和6-BA的離子化效率，影響質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度；150 mm色譜柱的峰型、分離效果及保留效果良好，2種化合物能達(dá)到一定分離度，且保留時(shí)間比較合適，有利于分析判斷。因此選擇Hypersil GOLD? C18（3 μm，150 mm×2.1 mm）色譜柱。

流動(dòng)相方面分別考察純水、添加0.1%甲酸水、乙酸銨水溶液及添加0.1%甲酸的乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相A，以乙腈作為流動(dòng)相B。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用純水+乙腈體系作為流動(dòng)相時(shí)4-CPA-Na和6-BA峰型均存在嚴(yán)重峰拖尾現(xiàn)象，化合物之間互相干擾，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。以5 mmol/L乙酸銨水溶液或添加體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相A時(shí)，峰型得到明顯改善，但流動(dòng)相中存在甲酸時(shí)4-CPA-Na離子強(qiáng)度受到明顯抑制，乙酸銨水溶液存在于流動(dòng)相中時(shí)6-BA離子強(qiáng)度有一定抑制，通過(guò)降低乙酸銨水溶液濃度6-BA離子強(qiáng)度逐步增強(qiáng)，乙酸銨水溶液濃度為5 mmol/L時(shí)達(dá)到最優(yōu)。最終選定5 mmol/L乙酸銨水溶液+乙腈作流動(dòng)相，梯度條件洗脫。

2.4 方法檢出限、定量限及線性關(guān)系

通過(guò)LC-MS/MS分析基質(zhì)空白提取液、加標(biāo)樣品、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，得到空白樣品、加標(biāo)樣品的SRM譜圖，如圖3和圖4所示；標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性方程如圖5所示。結(jié)果表明，4-CPA-Na和6-BA在0.1～20 ng/mL質(zhì)量濃度區(qū)間有良好線性關(guān)系。

根據(jù)林國(guó)斌等[13]方法檢出限的確定，根據(jù)公式方法檢出限（MLD）=k×Sb×C/X計(jì)算，其中，C為標(biāo)液濃度；k為置信因子，一般取3，確定4-CPA-Na檢出限位0.4 μg/kg，6-BA檢出限0.125 μg/kg；依據(jù)定量限（LOQ）與方法檢出限（MLD）的近似數(shù)量關(guān)系a（MLD）∶a（LOQ）=4∶10得到4-CPA-Na的定量限1.0 μg/kg，6-BA定量限0.50 μg/kg。

圖3 空白樣品4-CPA-Na和6-BA的SRM譜圖

圖4 加標(biāo)質(zhì)量濃度0.5 ng/mL時(shí)4-CPA-Na和6-BA的SRM譜圖

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 精密度和回收率

選取不含4-CPA-Na、6-BA的豆芽樣品，分別添加1.0，5.0和20.0 ng/mL 3種水平進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試，按試驗(yàn)方法進(jìn)行處理、測(cè)試；平行重復(fù)測(cè)定5次，得到平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），見(jiàn)表5。

2.6 樣品檢測(cè)

對(duì)流通環(huán)節(jié)抽檢的50個(gè)豆芽樣品進(jìn)行分析，4批次樣品檢出含有4-CPA-Na或6-BA，其中4-CPA-Na 3次檢出，最高含量2.24 μg/kg，6-BA 2次檢出，最高含量0.97 μg/kg?？傮w不合格率達(dá)到8.0%，可見(jiàn)豆芽中2種藥物濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，必須加強(qiáng)監(jiān)管。

表5 4-CPA-Na和6-BA平均回收率和精密度

3 結(jié)論

根據(jù)4-CPA-Na和6-BA特性，建立液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)測(cè)定豆芽菜中4-CPA-Na和6-BA含量的方法，通過(guò)比較各種樣品前處理方法，優(yōu)化儀器條件，使整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程更加簡(jiǎn)潔快速，且方法的靈敏度高，再現(xiàn)性好，完全滿足《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》對(duì)于豆芽中2種藥物的檢測(cè)分析。