李文，王偉 ，關(guān)榮發(fā)*，張玉，李雪，沈國新

1. 中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（杭州 310016）；2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院（杭州 310016）；3. 木本油料品質(zhì)營養(yǎng)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（杭州 310016）

角鯊烯（Squalene）又名鯊烯、鯊萜、角鯊油素、魚肝油萜，是一種高度不飽和的開鏈三萜類化合物，屬脂質(zhì)不皂化物。角鯊烯具有促進(jìn)心血管健康[1]、防癌抗癌[2]、抗抑郁[3]、解毒[4]、免疫[5]以及用于藥物緩釋[6]等方面的健康功效，但相關(guān)系統(tǒng)性的臨床研究還較為有限。角鯊烯主要來源于深海鯊魚肝油，植物性產(chǎn)品橄欖油中的角鯊烯含量較高，除了橄欖油[7]之外，其他植物油如南瓜籽油[8]、油茶籽油[9]、莧菜種子油[10]、香薷籽油[11]、靈芝孢子油[12]也或多或少含有角鯊烯。伴隨著角鯊烯在不同生物質(zhì)中的發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外學(xué)者對角鯊烯的含量和生物活性的研究也相繼展開。

橄欖油中角鯊烯的分析測定主要包括樣品前處理與定量定性分析。樣品前處理方法有傳統(tǒng)提取和新型提取兩類。其中有機(jī)溶劑提取法[13]、皂化法[14]為傳統(tǒng)提取方法，固相萃取法[15]、固相微萃取法[16]和超臨界CO2萃取法[17]為新型前處理方法。關(guān)于角鯊烯的檢測技術(shù)，有氣相色譜（Gas chromatography，GC）法[18]、高效液相色譜（Performance liquid chromatography，HPLC）法[19]、超高效液相色譜（Ultra high performance liquid chromatography，UPLC）法[20]、氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）法[21]等。但這些方法或是將油脂甲酯化[22]，直接測定甲酯化后的產(chǎn)物；或是將油脂皂化衍生化后進(jìn)行氣相色譜分析，操作溫度較高，測定過程可能會破壞樣品分子結(jié)構(gòu)；或是需要超臨界流體輔助，操作步驟繁瑣、前處理時間長、試劑用量大，不能達(dá)到角鯊烯快速檢測的要求。超高效液相色譜具有普通高效液相色譜所不具有的超高的分離度、速度和靈敏度，能夠與不同的檢測器聯(lián)用從而對不同物質(zhì)中的角鯊烯進(jìn)行分析，與氣相色譜相比又無需高純氣體輔助、無需衍生化處理、無需較高溫度，操作更簡便。固相萃取消除了極性化合物、色素等的干擾，凈化了樣品，同時保護(hù)了超高效液相色譜系統(tǒng)。此次試驗(yàn)采用固相萃取結(jié)合超高效液相色譜檢測技術(shù)，比較9種固相萃取小柱提取、凈化、富集橄欖油中的角鯊烯，進(jìn)行橄欖油中角鯊烯簡便、準(zhǔn)確、快速的檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

橄欖油（實(shí)驗(yàn)室購買）；角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)對照品（純度＞98.0%，東京化成工業(yè)株式會社），購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇、乙腈（色譜級），默克股份有限公司；正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮（分析級）、甲酸（色譜級），均購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；固相萃取凈化柱：Diol凈化柱（1 g/6 mL）、Florisil PR凈化柱（1 g/6 mL）、Silica凈化柱（1 g/6 mL）、Alumina-N凈化柱（1 g/6 mL）、NH2凈化柱（1 g/6 mL）、CN凈化柱（1 g/6 mL）、Carb凈化柱（1 g/6 mL）、PSA凈化柱（1 g/6 mL）、PA凈化柱（1 g/6 mL），購自上海Welchrom公司；0.22 μm有機(jī)微孔濾膜；電子分析天平，精度為0.1 mg；Anke TDL-5-A型臺式離心機(jī)，轉(zhuǎn)速≥3 000r/min；TM-2 Wiggens渦旋振蕩器，轉(zhuǎn)速≥2 000 r/min，德國維根斯；Supelco固相萃取儀；TTL-DCI型氮吹儀；Uplc I-class型超高效液相色譜儀配紫外（Ultraviolet，UV）檢測器，美國Waters公司；超純水（18.2 MΩ·cm），由青島富勒姆科技有限公司超純水器制。

1.2 橄欖油樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.12 g（精確至0.001 g）橄欖油樣品于10 mL離心管中，加入0.6 mL正己烷，渦旋混合均勻，待凈化。上樣前，首先用10 mL正己烷對固相硅膠萃取凈化柱進(jìn)行預(yù)淋洗；然后將待凈化橄欖油樣品上樣至固相硅膠萃取凈化小柱上，以1滴/s的速度通過已活化過的固相萃取柱；再用10 mL正己烷分2次潤洗離心管，然后轉(zhuǎn)移至固相硅膠萃取凈化小柱上，以1滴/s的速率洗脫角鯊烯，收集上樣流出液和洗脫液，在室溫下氮?dú)獯蹈?，殘余物? mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，待超高效液相色譜紫外檢測器（Ultra high performance liquid chromatography-平共處Ultraviolet，UPLC-UV）檢測。

1.3 色譜分析條件

色譜柱Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相為100%乙腈，等度洗脫，流速為0.20 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL；紫外檢測器檢測波長為210 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 600 μg/mL）的制備：準(zhǔn)確稱取0.080 0 g（精確至0.000 1 g）角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，加適量甲醇，振搖，使角鯊烯溶解后，再加甲醇定容至50 mL容量瓶中，充分振蕩溶解，過濾，儲存在棕色瓶中4 ℃以下保存?zhèn)溆?。使用時可根據(jù)需要稀釋成不同濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：精密量取適量角鯊烯對照品儲備液，加甲醇逐級稀釋成9，90，360，720和1 200 μg/mL的梯度角鯊烯系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 固相萃取凈化柱的選擇

要將橄欖油中角鯊烯進(jìn)行很好的分離凈化，固相萃取柱填料的選擇是試驗(yàn)的核心。由于角鯊烯極性較小，利用不同類型固相萃取小柱對角鯊烯的保留強(qiáng)度不同，此次試驗(yàn)比較了Diol、FL、SI、AL-N、NH2、CN、Carb、PSA、PA 9種類型的固相萃取柱對待分析物角鯊烯富集的影響。按1.2方法進(jìn)行處理，最后采用UPLC-UV分析檢測角鯊烯含量。

結(jié)果表明，9種類型凈化柱處理得到的角鯊烯均得到了良好分離，9種固相萃取小柱凈化角鯊烯的色譜圖如圖1所示。其中經(jīng)SI、PSA、Diol、FL固相柱處理得到的橄欖油樣品，雜峰較少。凈化效果最好的為SI凈化柱，其次為FL、Diol、PSA。選擇正己烷作為固相萃取柱活化洗脫劑，Diol凈化柱、AL-N凈化柱、NH2凈化柱、CN凈化柱、Carb凈化柱、PSA凈化柱、PA凈化柱、FL凈化柱作為角鯊烯分離純化固相萃取小柱時，部分油脂也被洗脫下來，其中經(jīng)Carb凈化柱、PSA凈化柱處理的橄欖油樣品，被洗脫下來的油脂為無色透明油脂，以上8種均未達(dá)到油脂與目標(biāo)物角鯊烯良好分離的目標(biāo)。

SI凈化柱對橄欖油樣品進(jìn)行前處理的結(jié)果表明，極性吸附劑硅膠將甘油三酯成分很好地保留在吸附劑上，而首先將待分析物角鯊烯洗脫下來，未發(fā)現(xiàn)油脂被洗脫下來，凈化效果良好。在1.3色譜分析條件下對同一橄欖油樣品進(jìn)行檢測，經(jīng)硅膠柱處理得到的角鯊烯回收率最高。經(jīng)9種固相萃取小柱凈化處理檢測到的角鯊烯回收率如圖2所示。因此，選擇硅膠凈化柱進(jìn)行橄欖油中角鯊烯的分離純化。

2.1.2 洗脫溶劑的選擇

選擇SI硅膠凈化柱，在同樣洗脫體積下，考察洗脫劑A（正己烷）、洗脫劑B（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=9∶1）、洗脫劑C（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=8∶2）、洗脫劑D（V（正己烷）∶V（三氯甲烷）=5∶1）、洗脫劑E（丙酮）5種不同洗脫溶劑對角鯊烯純化的影響。結(jié)果表明：在5種不同洗脫溶劑處理下的UPLC-UV圖譜中，角鯊烯均分離良好且峰型尖銳，但經(jīng)過洗脫劑B（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=9∶1）、洗脫劑C（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=8∶2）、洗脫劑D（V（正己烷）∶V（三氯甲烷）=5∶1）、洗脫劑E（丙酮）洗脫，SI硅膠凈化柱的色譜圖中雜峰較多，回收率低，因此選用洗脫劑A（正己烷）進(jìn)行角鯊烯洗脫，其效果最佳，結(jié)果見圖3。

圖1 9種固相萃取柱凈化處理角鯊烯色譜圖比較

圖2 9種固相萃取柱凈化處理檢測到的角鯊烯回收率

圖3 不同洗脫劑對角鯊烯回收率的影響

2.1.3 洗脫體積的選擇

以正己烷溶劑為洗脫劑，試驗(yàn)比較了不同的洗脫體積對角鯊烯回收率的影響，洗脫曲線見圖4。結(jié)果表明：當(dāng)洗脫溶劑正己烷體積＜10 mL時，角鯊烯回收率隨洗脫體積的增大而增大；當(dāng)洗脫體積≥10 mL時，角鯊烯回收率趨于平穩(wěn)。故采用10 mL正己烷作為洗脫劑。

圖4 不同洗脫體積對角鯊烯回收率的影響

2.2 UPLC分析條件的確定

在UPLC分析中，色譜的分離和數(shù)據(jù)的采集是同時進(jìn)行的。為了使角鯊烯組分達(dá)到較好分離，必須選擇合適的色譜分析條件，例如流動相、流速、柱溫、色譜柱類型。

2.2.1 流動相的選擇

在流速0.20 mL/min、柱溫30 ℃、紫外檢測波長210 nm、進(jìn)樣量2 μL的相同條件下，改變流動相，考察甲醇[23]、甲醇-水、乙腈、乙腈-水[24]、甲醇-甲酸水[25]體系對分離效果的影響。

在甲醇100%、甲醇-水、甲醇-0.2%甲酸水體系、乙腈100%、乙腈-水等流動相下，UPLC-UV色譜圖表明，經(jīng)9種類型的固相萃取凈化柱處理的橄欖油樣品中目標(biāo)物角鯊烯均與其他雜峰分離良好。在甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸水體系中，隨著有機(jī)相比例的增加，保留時間逐漸縮短。在甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水體系中，相同流動相配比下，乙腈-水體系下的角鯊烯保留時間最長。甲醇-水和甲醇-0.2%甲酸水體系下分離效果基本相同，而柱壓較低的乙腈-水流動相系統(tǒng)，更有助于保護(hù)UPLC色譜系統(tǒng)，故選擇乙腈-水流動相體系，考慮到柱子的使用壽命和樣品保留時間，選擇純乙腈為流動相。

2.2.2 流速的選擇

以純乙腈為流動相，色譜柱柱溫為30 ℃，紫外檢測器檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為2 μL，考察不同流動相的流速（0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL/min）對角鯊烯檢測的影響。

在0.10～0.30 mL/min流速范圍內(nèi)，流速增大，角鯊烯的保留時間均縮短。當(dāng)流速為0.10和0.15 mL/min時，角鯊烯出峰時間過長，且當(dāng)流速為0.1 mL/min時角鯊烯存在拖尾現(xiàn)象。當(dāng)流速＞0.20 mL/min時，角鯊烯出峰時間大大縮短但縫寬較窄。結(jié)合色譜系統(tǒng)壓力和角鯊烯保留時間，選擇0.20 mL/min作為流動相的流速。

2.2.3 柱溫的選擇

柱溫是重要的色譜操作條件之一，它直接影響色譜柱的選擇性、色譜峰區(qū)域展寬和分析速度。以純乙腈為流動相，流速為0.20 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為2 μL，考察不同柱溫（20，25，30，35和40 ℃）對橄欖油中角鯊烯分離的影響。結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同柱溫下角鯊烯色譜圖

在20～40 ℃柱溫范圍內(nèi)，峰形變化很小，樣品主峰與其他雜質(zhì)峰均分離良好，樣品的保留時間隨著柱溫的升高均縮短。因柱溫太高易損傷色譜柱，綜合考慮樣品的保留時間、柱子的使用壽命以及經(jīng)濟(jì)性和便利性等因素，柱溫選擇30 ℃。

2.2.4 色譜柱的選擇

由于角鯊烯極性很弱，適合用反相色譜柱，所以試驗(yàn)選用C18的反相柱。考察Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱對分離效果的影響。如圖6（a）所示，選擇Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱時，目標(biāo)物角鯊烯分離良好，但角鯊烯峰對稱性不好；選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱時，角鯊烯峰型尖銳，對稱性好。綜合考慮，選擇ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行角鯊烯的檢測分析。

圖6 不同色譜柱下角鯊烯色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

用1 600 μg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，以甲醇為溶劑進(jìn)一步稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為9，90，360，720和1 200 μg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)工作液系列。以角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，角鯊烯的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖7所示。以信噪比S/N=3以及S/N=10對應(yīng)的質(zhì)量濃度分別作為檢出限（limit of determination，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），結(jié)果見表1。

圖7 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 角鯊烯線性范圍及定量限

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確稱取0.12 g橄欖油樣品，經(jīng)硅膠柱提取處理后用甲醇定容至2 mL，每隔3 h進(jìn)樣2 μL，按照優(yōu)化的1.3色譜條件進(jìn)行定量分析。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表2。δRSD為0.049%，說明用該方法制成的供試樣品溶液中的角鯊烯在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密度是衡量可靠性的另一個指標(biāo)。在優(yōu)化的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6針角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。精密度δRSD為0.440%。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 回收率試驗(yàn)

加標(biāo)回收率是表示準(zhǔn)確度的一個指標(biāo)。用已知角鯊烯含量（4 994.18 mg/kg）的橄欖油樣品進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取9份0.12 g同一已知角鯊烯含量橄欖油樣品，每3份樣品為1組，每組分別準(zhǔn)確加入高、中、低3個水平的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品。樣品處理和角鯊烯的定量分析按1.2和1.3的優(yōu)化條件進(jìn)行。先測定添加樣品中的角鯊烯含量，減去已知角鯊烯含量（4 994.18 mg/kg）的橄欖油樣品，再計算添加回收率，加標(biāo)樣品的回收率結(jié)果見表4。角鯊烯的加標(biāo)回收率在98.38%～103.109%之間，平均添加回收率為100.836%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差δRSD為2.35%。表明該方法回收率較好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取某一種橄欖油，按照1.2條件進(jìn)行樣品預(yù)處理，并在1.3色譜條件下進(jìn)行檢測分析（平行試驗(yàn)，n=6），并計算重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差δRSD。結(jié)果如表5所示，重復(fù)性δRSD值為0.046%。結(jié)果表明在1.2的處理方法和1.3的色譜條件下，測定方法比較穩(wěn)定，測定數(shù)據(jù)重現(xiàn)好。

表4 加標(biāo)樣品的回收率結(jié)果

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 實(shí)際樣品測定

采用該方法對實(shí)驗(yàn)室中來自澳大利亞、突尼斯、希臘、意大利的6種橄欖油進(jìn)行檢測（平行試驗(yàn)，n=3），角鯊烯含量在1 907.364～5 191.548 mg/kg之間，在Salvo等[26]研究的1 448～7 474 mg/kg角鯊烯含量范圍之內(nèi)。由表6可知，在6種橄欖油中，澳大利亞特級初榨橄欖油中角鯊烯含量最高，達(dá)5 191.548 mg/kg，其次為編號2和1的意大利貝斯隆橄欖油，其中的角鯊烯含量分別為4 998.564和4 287.582 mg/kg。再次為希臘伊莉雅（4 048.285 mg/kg）和希臘卡利士多（3 577.879 mg/kg），突尼斯亨洛德莊園1#中角鯊烯含量為2 152.262 mg/kg，突尼斯亨洛德莊園2#中角鯊烯含量在所有油中含量是最低的（1 907.364 mg/kg），而同為澳大利亞的澳根尼橄欖油中角鯊烯含量僅2 047.671 mg/kg，說明橄欖油中角鯊烯的含量可能受地域和橄欖油品種的影響。

表6 實(shí)際樣品的測定

3 結(jié)論

橄欖油中角鯊烯含量的固相萃取-超高效液相色譜紫外檢測方法，具有操作簡便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。此次試驗(yàn)探討了不同色譜柱、固相萃取凈化柱、流動相、流速、柱溫對角鯊烯含量的影響，利用優(yōu)化方法快速定量檢測4個不同地區(qū)的6個品種的橄欖油中角鯊烯，其含量在1 907.364～5 191.548 mg/kg之間，這可能是由于種植環(huán)境和橄欖油品種不同所造成的。