張穎 ，陳璐，趙巧靈*，湯海鳳，吳益春，陳靜

1. 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院（舟山 316022）；2. 舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（舟山 316013）

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)漁業(yè)中不可或缺的組成部分，其中大黃魚(yú)是中國(guó)九大海水魚(yú)之一。根據(jù)《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)顯示[1]，2018年中國(guó)海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量149.5萬(wàn) t，其中大黃魚(yú)養(yǎng)殖量最大，達(dá)到19.80萬(wàn) t。但是隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，也存在關(guān)鍵養(yǎng)殖技術(shù)欠缺、育苗成活率偏低、產(chǎn)品質(zhì)量安全存在隱患等突出問(wèn)題。眾所周知，2006年“多寶魚(yú)事件”，在養(yǎng)殖大菱鲆中檢出違禁藥物，使得海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)遭到沉重打擊。因此，在海水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中，漁藥過(guò)量使用或禁用漁藥違法添加引起的藥物殘留問(wèn)題構(gòu)成危害水產(chǎn)品質(zhì)量安全的主要問(wèn)題。

喹諾酮類(lèi)藥物[3-4]屬于廣譜抗生素，可有效預(yù)防和治療多種傳染病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，在GB 31650—2019中規(guī)定魚(yú)中恩諾沙星等抗生素藥物最大殘留限量100 μg/kg。近年來(lái)，喹諾酮類(lèi)檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)中，凈化除脂的主要方法有固-液萃取法[5-6]、固相萃取法[7-9]、QuEChERS[10-11]等，其中冷凍除脂和固相萃取法耗時(shí)過(guò)程較長(zhǎng)，QuEChERS法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的檢測(cè)。Enhanced Matix Removal Lipid（EMRLipid）[12-15]，是一種根據(jù)油脂類(lèi)（如游離脂肪酸、磷脂、甘油三酯等）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有效去除脂質(zhì)的新型QuEChERS凈化劑，其能減少脂質(zhì)基質(zhì)對(duì)獸藥的吸附干擾。該技術(shù)尚未見(jiàn)用于養(yǎng)殖水產(chǎn)品中喹諾酮類(lèi)獸藥檢測(cè)的報(bào)道。試驗(yàn)以水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常用抗生素喹諾酮類(lèi)藥物作為研究對(duì)象，以大黃魚(yú)為代表作為研究基質(zhì)，基于QuEChERS EMR-Lipid結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，建立養(yǎng)殖水產(chǎn)品中15種獸藥殘留的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

G4220B/G6470A三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Multi Reax多管式旋渦混合器（德國(guó)Heidolph公司）；AVANTIJ-E高速離心器（BECKMAN COULTER公司）；N-EVAPTM-111氮吹濃縮儀（美國(guó)歐加農(nóng)公司）；KQ-600DV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；QGARD00R1超純水機(jī)（法國(guó)Millipore）。

15種喹諾酮類(lèi)抗生素（見(jiàn)表1）標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于94.0%，購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；乙腈、甲醇（德國(guó)默克股份良合公司）；甲酸（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；增強(qiáng)去脂萃取鹽包（m（無(wú)水MgSO4）∶m（NaCl）=4∶1）；增強(qiáng)型去脂分散凈化管（EMR-Lipid dSPE管，1 g，15 mL）。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱(chēng)取15種喹諾酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈作為定溶液，配制標(biāo)準(zhǔn)混合液100 μg/mL，冷凍貯藏（-18 ℃）。使用時(shí)，以含0.1%甲酸的10%乙腈溶液作為定溶液，梯度稀釋成5個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2 樣品前處理

稱(chēng)取2 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后的大黃魚(yú)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入陶瓷均質(zhì)子（2粒），先加入2 mL 1%甲酸水溶液后渦旋2 min，再加入8 mL 1%甲酸乙腈溶液，接著加入增強(qiáng)去脂萃取鹽包，快速渦旋振蕩2 min分散均勻，超聲15 min，以3 000 r/min離心5 min；取上層液轉(zhuǎn)移到QuEChERS EMR-Lipid dSPE管中，快速渦旋2 min，以5 000 r/min離心5 min；取上清液到15 mL離心管中，于50 ℃水浴氮吹至干。加1 mL 10%乙腈溶液（含0.1%甲酸）進(jìn)行復(fù)溶，超聲溶解后過(guò)0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱采用Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A采用0.2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B采用0.2%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～0.5 min，2% B；0.5～1.8 min，2%～15% B；1.8～6.0 min，15%～25% B；6.0～6.5 min，25%～20% B；6.5～7.0 min，20%～30% B；7.0～11.0 min，30%～35% B；11.0～16.0min，35%～100% B；6.0～20.0 min，100% B。流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量5.0 μL。

質(zhì)譜條件：氣體溫度350 ℃；氣體流量5 L/min；霧化器壓力45 psi；鞘氣溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓正4 500 V，負(fù)3 500 V；噴嘴電壓正500 V，負(fù)500 V。電噴霧電離正模式（ESI+）；檢測(cè)模式采用MRM模式。15種化合物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）、豐度比、去簇電壓、碰撞能等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 15種喹諾酮抗生素的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為獲得15種喹諾酮類(lèi)抗生素的質(zhì)譜最優(yōu)參數(shù)，選擇正離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，獲得精準(zhǔn)母離子（m/z），優(yōu)化15種化合物的毛細(xì)管電壓和去簇電壓參數(shù)；為獲得15種化合物的2個(gè)或以上的子離子（m/z），進(jìn)行全掃描，以二級(jí)質(zhì)譜獲得最高豐度和第二高豐度的碎片離子分別作為定量離子和定性離子，并優(yōu)化15種化合物的碰撞電壓，使得每種化合物離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大，15種抗生素優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 流動(dòng)相優(yōu)化

比較4種不同流動(dòng)相（甲醇-水溶液，乙腈-水溶液，乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液和0.2%乙腈-0.2%甲酸水溶液）對(duì)15種化合物的響應(yīng)、峰形和分離效果的影響。結(jié)果表明，依諾沙星在甲醇-水溶液中不能被有效分離，添加乙酸銨的流動(dòng)相依諾沙星響應(yīng)較低，流動(dòng)相中加0.2%甲酸可顯著提高15種化合物的豐度值。因此，選用0.2%乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，15種喹諾酮類(lèi)抗生素（1 μg/mL）的選擇性離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 15種喹諾酮類(lèi)抗生素（1 μg/mL）的選擇性離子流圖

2.3 提取溶劑優(yōu)化

查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，喹諾酮類(lèi)抗生素分析中多采用乙腈作為提取溶劑。大黃魚(yú)是高蛋白高脂肪的水產(chǎn)魚(yú)種，乙腈對(duì)高脂肪高蛋白的基質(zhì)可達(dá)到有效提取目標(biāo)化合物的目的；同時(shí)考察在提取溶劑中加入適量甲酸提高抗生素的提取效率。比較3種提取溶劑，分別為乙腈、1%甲酸乙腈溶液和1%甲酸乙腈水溶液（V（乙腈）∶V（水）=4∶1），對(duì)抗生素藥物的回收率影響。由結(jié)果可知，1%甲酸乙腈水溶液提取效果最優(yōu)，15種喹諾酮抗生素回收率在83.5%～106.4%。因此，選用1%甲酸乙腈水溶液作為提取溶液。

2.4 線性關(guān)系與檢出限

在1～200 ng/mL線性范圍內(nèi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)，從表2中可知，15種喹諾酮類(lèi)抗生素在相對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）＞0.998（除依諾沙星之外）。以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限（LOD），15種喹諾酮類(lèi)抗生素的LOD為0.5～2.0 μg/kg。

2.5 方法的回收率與精密度

選取空白大黃魚(yú)樣品分別進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)（n=6）。由表2可知，在加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，15種目標(biāo)物的平均回收率為75.8%～112.3%，δRSD為2.3%～10.2%。方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性均滿足定量分析的要求。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用試驗(yàn)建立方法對(duì)購(gòu)買(mǎi)于市場(chǎng)上6種養(yǎng)殖水產(chǎn)樣品，包括大黃魚(yú)、鯽魚(yú)、鳊魚(yú)、大菱鲆、黃顙魚(yú)、黑魚(yú)，進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星、氧氟沙星在大黃魚(yú)、大菱鲆中均有檢出，恩諾沙星檢出含量在20～80 μg/kg，氧氟沙星檢出含量在10～50 μg/kg，結(jié)果表明所建立的方法能滿足日常檢測(cè)需求。

表2 15種待測(cè)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限、回收率和精密度

3 結(jié)論

基于QuEChERS EMR-Lipid凈化技術(shù)結(jié)合UPLCMS/MS技術(shù)用于水產(chǎn)品中15種喹諾酮類(lèi)抗生素的快速檢測(cè)，采用1%甲酸乙腈水溶液作為提取溶液，經(jīng)過(guò)EMR-Lipid的高效去脂凈化過(guò)程，有效提高方法的靈敏度和準(zhǔn)確度，成功應(yīng)用養(yǎng)殖水產(chǎn)樣品中15種喹諾酮類(lèi)抗生素的檢測(cè)，具有較好的適用性和應(yīng)用性。