李世堅(jiān)，焦愛軍

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是耳鼻咽喉科常見惡性腫瘤，其發(fā)病因素包括遺傳因素、環(huán)境因素及EB病毒感染等[1-2]。鼻咽癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，采用放化療也僅80%左右的患者病情得到控制，而靶向治療因費(fèi)用高昂，在臨床上應(yīng)用具有局限性[3-4]。因此，臨床上在不斷尋找可以更好地控制鼻咽癌、解決臨床難題的藥物。近年來中草藥單體在抗腫瘤活性方面的研究有很大進(jìn)展[5]。本研究篩選抗鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)中得到香加皮中的杠柳苷元單體有較強(qiáng)的抗鼻咽癌低分化CNE2細(xì)胞的活性，而目前關(guān)于杠柳苷元抗鼻咽癌的報(bào)道較少。本研究試圖明確杠柳苷元抗鼻咽癌細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 杠柳苷元標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，分子式：C23H34O5，生產(chǎn)批號(hào)：BP1613，購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。目的基因擴(kuò)增引物由華大基因科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 低分化NPC細(xì)胞系CNE2細(xì)胞，購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 主要儀器 CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測試劑盒購自美國普洛麥格公司，熒光定量PCR儀(型號(hào)7500)購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司，低速離心機(jī)(型號(hào)WTL-4K)購自湘儀集團(tuán)，渦旋震蕩器(型號(hào)MZX-28+)購自杭州米歐儀器公司，數(shù)顯恒溫水浴箱(型號(hào)HH-W420)購自江蘇金怡儀器公司，移液器購自美國賽默飛世爾公司。

1.4 CellTiter-Glo發(fā)光法檢測杠柳苷元對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長抑制 取對(duì)數(shù)生長期的鼻咽癌CNE2細(xì)胞，以每孔100 μl密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后棄上清。各組分別加入100 μl含杠柳苷元0.5 μmol/L、1.5 μmol/L、3 μmol/L、5 μmol/L、7 μmol/L的RPMI-1640培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，每孔分別加入100 μl提前24 h 4 ℃解凍的CellTiter-Glo液體，于振蕩儀上震蕩10 min，然后用酶標(biāo)儀在Luminescent模式下檢測每孔的吸光度(A)，并用空白對(duì)照組調(diào)零，根據(jù)各孔的吸光度(A)計(jì)算IC50(半抑制濃度)值。抑制率(IR%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.5 qRT-PCR檢測檢測鼻咽癌細(xì)胞凋亡基因 取對(duì)照組以及1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L杠柳苷元處理48 h的CNE2細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物的序列和檢測程序見表1、2。

表1 引物序列

表2 檢測程序

1.6 Western blot檢測CNE2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶 取對(duì)數(shù)生長期CNE2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)組各孔加入1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L的杠柳苷元，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照caspase-3蛋白酶活性檢測試劑盒說明書的要求進(jìn)行操作，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(0.5 mg/ml)加入待測孔內(nèi)，酶標(biāo)儀檢測562 nm處的OD值。依照校準(zhǔn)曲線和樣品體積計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 杠柳苷元對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響 在一定濃度范圍內(nèi)，隨杠柳苷元濃度升高，對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用增加。見圖1。通過曲線得杠柳苷元作用于CNE2細(xì)胞在48 h的IC50為1.712 μmol/L。

圖1 杠柳苷元對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 CNE2細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，杠柳苷元濃度為1 μmol/L的caspase-3 mRNA表達(dá)量少量上升作用不明顯、2 μmol/L的caspase-3 mRNA表達(dá)量上升，有一定的作用(P<0.05)。而濃度為4 μmol/L的caspase-3 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)。與對(duì)照組相比，不同濃度下杠柳苷元的EGFR mRNA的表達(dá)量影響結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

2.3 CNE2細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白酶的表達(dá) 各個(gè)細(xì)胞組的內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量基本一致，說明了2種細(xì)胞的的各組的上樣質(zhì)量一致，目的蛋白的表達(dá)量變化是情況的有意義的。杠柳苷元處理CNE2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比較，杠柳苷元組的caspase-3蛋白酶的表達(dá)水平皆顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EGFR蛋白酶表達(dá)量與對(duì)照組相差不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

3 討 論

杠柳苷元具有抗炎、強(qiáng)心、利尿及抗腫瘤等作用，其藥物開發(fā)潛力較大[6-8]。既往在抗腫瘤細(xì)胞相關(guān)的早期篩選實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)杠柳苷元即使在純度很低的情況下也能對(duì)抗多種腫瘤細(xì)胞，即有顯著的細(xì)胞毒性，并且杠柳苷元相關(guān)溶血實(shí)驗(yàn)顯示未見溶血反應(yīng)，由此推測杠柳苷元具有研發(fā)的潛在價(jià)值[8]。本研究使用不同濃度杠柳苷元處理低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2，結(jié)果顯示，杠柳苷元對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)一定濃度依賴關(guān)系，表明杠柳苷元能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖。本研究中杠柳苷元作用于CNE2細(xì)胞在48 h的IC50為1.712 μmol/L，充分顯示出杠柳苷元可通過作用于CNE2發(fā)揮抗鼻咽癌的顯著作用。與韓宇博等[11]研究中杠柳苷元對(duì)不同來源的腫瘤細(xì)胞的IC50范圍(0.46～1.50 μg/ml)相差不大。

注：C.對(duì)照組；1.1 μmol/L；2.2 μmol/L；4.4 μmol/L；與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

目前對(duì)于治療惡性腫瘤的共識(shí)為抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞的正常凋亡可維持生物的組織、器官的完整性及平衡性。當(dāng)生物體內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑發(fā)生紊亂，突變的細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡的途徑卻不能消除，從而導(dǎo)致該突變細(xì)胞不斷積累，最終癌化，形成腫瘤[12-14]。本研究通過設(shè)置不同濃度的杠柳苷元作用于CNE2細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1 μmol/L、2 μmol/L杠柳苷元濃度處理的鼻咽癌細(xì)胞中caspas-3 mRNA表達(dá)量均下調(diào)，差異明顯，而濃度為4 μmol/L的杠柳苷元組caspas-3 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，差異顯著。這提示不同濃度杠柳苷元對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞中caspas-3 mRNA表達(dá)的影響不同，而4 μmol/L的杠柳苷元更有利于通過上調(diào)caspas-3 mRNA，從而達(dá)到誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的目的。受實(shí)驗(yàn)局限性影響，本實(shí)驗(yàn)并未檢測更多不同濃度杠柳苷元處理下鼻咽癌細(xì)胞中caspas-3 mRNA的表達(dá)，因此關(guān)于杠柳苷元上調(diào)caspas-3 mRNA的最適宜的濃度還有待更多實(shí)驗(yàn)研究。而不同濃度杠柳苷元處理下鼻咽癌CNE2細(xì)胞中EGFR的表達(dá)相差不大，提示杠柳苷元可能對(duì)EGFR的影響不大，也可能與杠柳苷元的濃度不足以影響CNE2細(xì)胞有關(guān)，有待更多研究驗(yàn)證。本研究采用Western blot對(duì)caspas-3及EGFR蛋白酶進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-3蛋白酶表達(dá)水平皆較對(duì)照組上調(diào)，而杠柳苷元對(duì)EGFR蛋白酶表達(dá)水平影響不大。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了杠柳苷元可通過對(duì)caspase-3的調(diào)控而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，杠柳苷元可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能為通過上調(diào)凋亡基因caspase-3及其蛋白酶的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。