王耀，劉勝男，邢榮花，張淑霞，王玲玲，郭保寶

1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（洛陽 471023）；2. 三門峽海關(guān)（三門峽 472000）；3. 安陽海關(guān)（安陽 455000）；4. 鄭州海關(guān)技術(shù)中心（鄭州 450002）；5. 三門峽市檢驗(yàn)檢疫中心（三門峽 472000）

隨著生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)食品安全程度的關(guān)注水平也發(fā)生了變化，不僅關(guān)注食源性致病菌、農(nóng)獸藥殘留、違法添加等外源性問題，而且關(guān)注轉(zhuǎn)基因、食物過敏等內(nèi)源性問題。食物過敏是人體暴露于某種食物后反復(fù)發(fā)生，由特定免疫應(yīng)答引起的不良反應(yīng)[1]。致敏物質(zhì)通常為食物中的蛋白質(zhì)或糖蛋白[2]。近年來，食物過敏發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[3]，但由于缺乏有效治療方法，患者只能通過避免食用含致敏物質(zhì)的食物以防止過敏反應(yīng)[4]。因此，很多國家通過頒布法規(guī)或標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)食品標(biāo)簽中標(biāo)識(shí)致敏物質(zhì)進(jìn)行強(qiáng)制要求[5]。中國現(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》中將致敏物質(zhì)標(biāo)識(shí)作為推薦內(nèi)容，但在最新的修訂征求意見稿中將致敏物質(zhì)作為基本標(biāo)示內(nèi)容。因此，研究食品中致敏物質(zhì)的高效快速、靈敏特異檢測(cè)方法對(duì)于致敏物質(zhì)標(biāo)識(shí)監(jiān)管、保障過敏消費(fèi)者食品安全具有重要意義。

花生是八大主要致敏食物之一[6]，其含有多種致敏蛋白，因此花生及其制品在很多國家和地區(qū)的食品標(biāo)簽要求中被列為需要標(biāo)識(shí)的致敏物質(zhì)之一。已鑒定出的花生致敏蛋白有13種，其中Ara h 2是主要致敏蛋白之一，能被大多數(shù)花生過敏患者的血清識(shí)別[7]。Ara h 2占花生蛋白總量的5.9%～9.3%，由于結(jié)構(gòu)中二硫鍵較多使其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、耐酶解的特點(diǎn)[8]。用于花生致敏物質(zhì)檢測(cè)的方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和質(zhì)譜法（MS）等方法[9]，其中PCR和ELISA是食品中致敏成分篩查中最常用的快速定性和定量分析方法[10]。PCR方法基于標(biāo)志性基因進(jìn)行檢測(cè)，難以準(zhǔn)確反映是否含有致敏物質(zhì)[11]，而ELISA方法可直接針對(duì)致敏蛋白進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)基于所制備的Ara h 2兔源多抗和鼠源單抗，通過雙抗體夾心檢測(cè)原理，建立花生致敏蛋白Ara h 2的ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)其檢測(cè)特性進(jìn)行鑒定，以期為食品標(biāo)簽中致敏物質(zhì)標(biāo)識(shí)的高效監(jiān)管提供支撐，更好地保障過敏消費(fèi)者的食品安全。

1 材料與方法

1.1 試劑與溶液

花生致敏蛋白Ara h 1、Ara h 2（美國INDOOR生物技術(shù)公司）；大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白、3, 3’, 5, 5’-四甲基聯(lián)苯胺（美國Sigma-Aldrich試劑公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（索萊寶生物科技公司）；Ara h 2鼠源單抗、Ara h 2兔源多抗及超純水由實(shí)驗(yàn)室制備；其他試劑（均為市售分析級(jí)）。

ELISA包被液采用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（CBS）；稀釋液采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）；洗滌液含0.05% tween-20的PBS（PBST）；封閉液含5%脫脂奶的PBST溶液；顯色液采用3, 3’, 5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）緩沖液；終止液采用2 mol/L H2SO4溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S型電子天平（德國Sartorius公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；Vortex2型振蕩器（艾卡儀器設(shè)備有限公司）；SZCL-2型控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HPX-9052MBE型恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 雙抗體夾心ELISA基本步驟

利用Ara h 2 鼠源單抗（mAb）作為捕獲抗體，用于ELISA酶標(biāo)板的包被。將mAb用CBS稀釋，加入100 μL/孔酶標(biāo)板，4 ℃條件下包被過夜；洗板，即用PBST沖洗酶標(biāo)板4次并拍干（下同），拍干后將封閉液加入200 μL/孔酶標(biāo)板，37 ℃條件下封閉1 h；洗板并將包被好的酶標(biāo)板在4 ℃條件下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將樣液加入100 μL/孔酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)置陰性孔（加入PBS 100 μL），37 ℃條件下孵育1 h后洗板；利用Ara h 2 兔源多抗（pAb）作為檢測(cè)抗體，將pAb用封閉液稀釋，加入100 μL/孔酶標(biāo)板，37 ℃條件下孵育30 min后洗板；將HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（GaRIgG-HRP）用封閉液按1∶5 000倍稀釋，加入100 μL/孔酶標(biāo)板，37 ℃條件下孵育30 min后洗板；將顯色液加入100 μL/孔酶標(biāo)板，室溫靜置反應(yīng)10 min；將終止液加入100 μL/孔酶標(biāo)板終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值。

1.3.2 捕獲抗體和檢測(cè)抗體工作濃度的優(yōu)化

采用棋盤法優(yōu)化抗體工作濃度[12]。將mAb用CBS稀釋為1∶5 000，1∶10 000，1∶15 000和1∶20 000這4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度100 μL/孔包被酶標(biāo)板2行（包被程序同上）。將確定濃度的Ara h 2標(biāo)準(zhǔn)溶液加入第1行100 μL/孔，將PBS作為陰性對(duì)照加入第2行100 μL/孔，37 ℃條件下孵育1 h后洗板；將pAb用封閉液稀釋為1∶5 000，1∶10 000，1∶15 000和1∶20 000這4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度100 μL/孔加入3列酶標(biāo)板，37 ℃條件下孵育30 min后洗板；加入GaRIgG-HRP孵育，顯色、終止并讀取OD450nm值。得到各稀釋度下測(cè)定Ara h 2標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD450nm平均值（P值）和陰性對(duì)照的OD450nm平均值（N值），將P/N最大時(shí)所對(duì)應(yīng)mAb和pAb的稀釋度分別作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體的最佳工作濃度。

1.3.3 方法檢測(cè)特性鑒定

1.3.3.1 靈敏度鑒定

靈敏度通過方法的檢測(cè)限（LOD）確定，檢測(cè)限越低，則靈敏度越高。利用優(yōu)化抗體工作濃度后的雙抗體夾心ELISA對(duì)一系列梯度濃度的Ara h 2標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。將各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，檢測(cè)所得OD450nm值作為縱坐標(biāo)，得到雙抗體夾心ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。重復(fù)檢測(cè)20次空白樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算求得濃度，計(jì)算濃度平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（δSD），以X+3δSD作為方法的檢測(cè)限[13]。

1.3.3.2 準(zhǔn)確度鑒定

將5%脫脂奶作為添加基質(zhì)，向其中加入Ara h 2標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成不同添加濃度的樣品，利用雙抗體夾心ELISA對(duì)每個(gè)濃度樣品重復(fù)檢測(cè)6次，通過計(jì)算添加回收試驗(yàn)的平均回收率及變異系數(shù)（CV）以鑒定方法的準(zhǔn)確度[14]。

1.3.3.3 特異性鑒定

通過交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定方法的特異性[15]。分別配制高濃度的花生致敏蛋白Ara h 1、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白等其他常見致敏蛋白溶液，利用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)并設(shè)置陰性對(duì)照。若其他致敏蛋白的OD450nm值（P值）和陰性對(duì)照OD450nm值（N值）的比值P/N小于2.1，則說明與其他致敏蛋白無交叉反應(yīng)，特異性良好。

1.3.3.4 穩(wěn)定性鑒定

將已包被mAb的酶標(biāo)板在4 ℃條件下避光密封保存，分別在保存的0，30，60和90 d時(shí)，利用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)特定濃度的Ara h 2標(biāo)準(zhǔn)溶液并設(shè)置陰性對(duì)照，計(jì)算P/N值，通過對(duì)比不同保存時(shí)間檢測(cè)所得P/N值的差異鑒定方法的穩(wěn)定性[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 捕獲抗體和檢測(cè)抗體的工作濃度

利用已包被不同稀釋度mAb的酶標(biāo)板進(jìn)行棋盤試驗(yàn)，通過不同稀釋度的pAb對(duì)50 ng/mL的Ara h 2標(biāo)準(zhǔn)溶液及陰性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)所得到的不同抗體稀釋度對(duì)應(yīng)的OD450nm值計(jì)算P/N值。結(jié)果如表1所示，mAb以1∶15 000稀釋包被酶標(biāo)板，pAb以1∶10 000稀釋進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，計(jì)算所得P/N值最大，因此捕獲抗體mAb和檢測(cè)抗體pAb最佳工作濃度分別為1∶15 000稀釋和1∶10 000稀釋。

表1 捕獲抗體和檢測(cè)抗體工作濃度的優(yōu)化

2.2 靈敏度

配制1，2，4，8，16，32，64，128和256 ng/mL的Ara h 2標(biāo)準(zhǔn)溶液用于建立方法標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)所得OD450nm值為縱坐標(biāo)，得到如圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性范圍為2～128 ng/mL，回歸方程為y=1.348 6x-0.368 6（R2=0.986 7）。通過重復(fù)檢測(cè)空白樣品，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（δSD），方法檢測(cè)限X+3δSD為2.32ng/mL，說明雙抗體夾心ELISA的靈敏度較高。

2.3 準(zhǔn)確度

分別配制10，50和100 ng/mL 3個(gè)Ara h 2添加濃度5%脫脂奶溶液樣品，利用雙抗體夾心ELISA對(duì)每個(gè)添加濃度的樣品進(jìn)行6次重復(fù)檢測(cè)。各添加濃度溶液樣品的平均回收率及CV結(jié)果如表2所示?；厥章侍幱?7.6%～93.3%，CV處于7.3%～10.7%，表明方法準(zhǔn)確度較高。

圖1 雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 雙抗體夾心ELISA準(zhǔn)確度鑒定結(jié)果

2.4 特異性

分別配制質(zhì)量濃度為200 ng/mL花生致敏蛋白Ara h 1、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和牛血清蛋白溶液。利用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)所得OD450nm值（P值）和陰性對(duì)照OD450nm值（N值）結(jié)果如表3所示。各致敏蛋白的P/N值均小于2.1，說明方法與其他常見致敏蛋白無交叉反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性。

表3 雙抗體夾心ELISA特異性鑒定結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性

利用雙抗體夾心ELISA分別在已包被mAb酶標(biāo)板保存的0，30，60和90 d檢測(cè)50 ng/mL的Ara h 2標(biāo)準(zhǔn)溶液，P值和N值結(jié)果如表4所示，在不同保存時(shí)間，P/N值均無較大變化，表明在4 ℃避光密封保存條件下，酶標(biāo)板可穩(wěn)定保存至少90 d，說明方法具有良好穩(wěn)定性。

表4 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法穩(wěn)定性鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

依據(jù)雙抗體夾心ELISA原理，利用Ara h 2鼠源mAb作為捕獲抗體，提高對(duì)于單一致敏蛋白的高親和力特異性捕獲能力，以Ara h 2兔源pAb作為夾心檢測(cè)抗體，增強(qiáng)對(duì)致敏蛋白的高效識(shí)別，建立可靈敏準(zhǔn)確、特異穩(wěn)定的檢測(cè)花生致敏蛋白Ara h 2的雙抗體夾心ELISA方法。通過對(duì)檢測(cè)特性進(jìn)行鑒定，方法檢測(cè)限為2.32 ng/mL，添加回收試驗(yàn)回收率為87.6%～93.3%，方法與其他致敏蛋白無交叉反應(yīng)，且可在4 ℃避光密封條件下保持90 d內(nèi)檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。試驗(yàn)方法與已有的基于多抗研制的商品化ELISA試劑盒相比[17]，在靈敏度和特異性上表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，可用于食品標(biāo)簽中花生致敏物質(zhì)標(biāo)識(shí)信息的快速篩查，為食品安全監(jiān)管提供高效的監(jiān)測(cè)手段和技術(shù)支撐。