歐陽(yáng)麗，王朝霞，汪輝，何海琴，胡曉博，袁圓

長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（長(zhǎng)沙 410013）

5-HMF具有細(xì)胞毒性，對(duì)上呼吸道、眼睛、皮膚、黏膜等具有刺激作用，過(guò)量攝入會(huì)降低細(xì)胞酶活性、損害肝功能甚至致癌[1-2]。研究表明，食品中的5-HMF主要由2種化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生：一種是己糖的酸催化反應(yīng)，即葡萄糖、果糖等單糖在酸性條件下脫水；另一種是美拉德反應(yīng)，蛋白質(zhì)、氨基酸中的游離氨基與單糖中羰基之間發(fā)生縮合反應(yīng)[3-5]。多價(jià)金屬陽(yáng)離子（如Ca2+、Mg2+）在美拉德反應(yīng)中起催化作用，能促進(jìn)5-HMF生成[3]。茶葉富含蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、糖類、礦物質(zhì)等成分，加工過(guò)程中存在熱處理環(huán)節(jié)（如殺青、萎凋、干燥等），極可能產(chǎn)生5-HMF。為使茶葉外觀更緊結(jié)、更有光澤，增甜增重，以次充好，許多不良商家在茶葉加工過(guò)程中非法添加蔗糖[6-8]。蔗糖也是產(chǎn)生5-HMF的底物之一[3,9]。

茶葉飲品被譽(yù)為世界三大飲料之一，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖等功效[10]。飲茶在中國(guó)不僅是一種生活習(xí)慣，更是一種源遠(yuǎn)流長(zhǎng)的文化傳統(tǒng)。中國(guó)是茶葉生產(chǎn)大國(guó)，同時(shí)也是茶葉的消耗大國(guó)，控制和檢測(cè)茶葉中5-HMF含量具有重要意義。5-HMF的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[11-13]、氣相色譜（GC）法[14-15]、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法[16-17]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法[18-24]等。由于復(fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)，HPLC與GC易產(chǎn)生假陽(yáng)性，靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，較難滿足茶葉中5-HMF的測(cè)定；GC-MS雖然具有較高的選擇性、靈敏度與準(zhǔn)確度，但分析時(shí)間長(zhǎng)，分析效率不高；HPLC-MS/MS特別是UPLC-MS/MS具有分析速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在分析檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

試驗(yàn)根據(jù)5-HMF的理化性質(zhì)，采用純水提取，HLB固相萃取小柱凈化，甲醇洗脫，氮吹濃縮至近干，流動(dòng)相復(fù)溶后，采用UPLC-MS/MS對(duì)茶葉中的5-HMF進(jìn)行分析檢測(cè)，建立一種測(cè)定茶葉中5-HMF方法，為茶葉中5-HMF含量的監(jiān)控提供技術(shù)支撐與方法儲(chǔ)備，為消費(fèi)者購(gòu)買茶葉提供安全保障基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，北京鎮(zhèn)翔科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；甲酸（HPLC級(jí)，天津市化學(xué)試劑研究所有限公司）；氨水（色譜純，上海市生化科技股份有限公司）；茶葉為抽檢樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC?H-Class/Xevo?TQ-S Micro超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）（美國(guó)Waters公司）；SK-1型快速混勻器（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）；CT14D-高速離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）；Visiprep-DL 24固相萃取真空裝置（Sigma-Aldrich公司）；AS3120超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；MV5全自動(dòng)高通量平行濃縮儀（Labtech公司）；超純水儀（法國(guó)默克密理博公司）；Oasis prime HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國(guó)Waters公司）；C18固相萃取柱（60 mg，3 mL，迪馬科技有限公司）；MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國(guó)Waters公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱采用Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×150mm，1.8 μm）；流動(dòng)相采用0.1%甲酸水溶液-甲醇（90∶10，V/V）等度洗脫；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源ESI，正離子模式；毛細(xì)管電壓3.0 kV；源溫度120 ℃；錐孔氣流量60 L/h；脫溶劑氣溫度350℃；脫溶劑氣流量700 L/h；數(shù)據(jù)采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），監(jiān)測(cè)參數(shù)如表1所示。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取10 mg 5-HMF至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存；準(zhǔn)確移取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度為2，5，10，50，100，200和500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.5 樣品制備

稱取0.5 g粉碎混勻后的茶葉樣品于100 mL錐形瓶中，加入50 mL水常溫超聲提取12 min，以10 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確移取5.0 mL過(guò)Oasis prime HLB固相萃取柱（預(yù)先經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化），加2 mL 5%氨水溶液淋洗，待淋洗液完全流出后，用4 mL水洗至中性，用真空泵抽干固相萃取柱，用8 mL甲醇洗脫。整個(gè)固相萃取過(guò)程流速均為1～2滴/s。洗脫液于45 ℃氮吹濃縮至近干，加入1.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，溶液以0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

5-HMF液質(zhì)檢測(cè)時(shí)常選用大氣壓化學(xué)電離源（APCI）[25]或電噴霧電離源（ESI源）[18-24]。一級(jí)質(zhì)譜掃描（MS1 Scan）時(shí)，ESI源的響應(yīng)值優(yōu)于APCI源，且正離子模式（ESI+）比負(fù)離子模式（ESI-）響應(yīng)高出約2個(gè)數(shù)量級(jí)，因此選用ESI+作為質(zhì)譜的電離方式。ESI+電離時(shí)，5-HMF與流動(dòng)相中甲酸提供的H+結(jié)合，形成母離子[M+H]+，質(zhì)荷比為127，優(yōu)化樣品錐孔電壓（Cone電壓）使其響應(yīng)最強(qiáng)；二級(jí)質(zhì)譜掃描時(shí)，[M+H]+離子在碰撞氣與碰撞能的作用下，得到其碎片離子（子離子），如圖1所示，其中質(zhì)荷比為109，81和53的碎片離子豐度最高，根據(jù)文獻(xiàn)[18, 26]報(bào)導(dǎo)，5-HMF的ESI+裂解機(jī)理為母離子[M+H]+先失去1分子水形成[M+H-H2O]+（質(zhì)荷比109），脫去1個(gè)羰基產(chǎn)生碎片[M+H-H2O-CO]+（質(zhì)荷比81），C—O鍵斷裂，開環(huán)，得到質(zhì)荷比53的碎片離子[M+H-H2O-2CO]+。試驗(yàn)選擇豐度最高的碎片109作為定量離子，碎片81與53作為定性離子，優(yōu)化3個(gè)碎片離子的碰撞能，使其響應(yīng)值最高。

圖1 5-HMF的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)選擇XBridge BEH Amide柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）、Venusil Hilic柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）和Agilent SB-C18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）3種不同性能的色譜柱對(duì)5-HMF進(jìn)行分離分析。這3種色譜柱各具特點(diǎn)，其中，XBridge BEH Amide柱擁有化學(xué)穩(wěn)定、三鍵鍵合的酰胺基鍵合相，性能卓越且分離對(duì)象的極性范圍廣；Venusil HILIC柱具有強(qiáng)極性固定相，常用于改善強(qiáng)極性化合物在反相色譜中的保留行為；Agilent SB-C18柱分離性能優(yōu)越，化學(xué)穩(wěn)定性好。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用XBridge BEH Amide柱與Venusil Hilic柱時(shí)，5-HMF的色譜峰峰型不對(duì)稱，響應(yīng)低；使用Agilent SB-C18色譜柱能獲得比其他兩者高出約1個(gè)數(shù)量級(jí)的響應(yīng)值，且峰型對(duì)稱，故試驗(yàn)選擇Agilent SB-C18柱作為分離用色譜柱。

2.3 色譜分離的優(yōu)化

甲酸或乙酸常被添加到流動(dòng)相中以提高ESI+電離模式下目標(biāo)物的離子化效率，試驗(yàn)采用0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相。流動(dòng)相流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，優(yōu)化流動(dòng)相比例以獲得目標(biāo)峰理想的分離度與分離效果。不同流動(dòng)相比例下5-HMF的總離子流圖如圖2所示。V（0.1%甲酸水溶液）∶V（甲醇）=80∶20時(shí)，5-HMF的保留時(shí)間約2 min，出峰太早不利于與干擾組分分離，逐漸升高水相的比例，5-HMF的保留時(shí)間不斷后移，同時(shí)色譜峰變寬；甲酸水溶液升高到90%時(shí)，5-HMF峰型對(duì)稱，分離效果好；甲酸水溶液升高到95%時(shí)，色譜峰峰型對(duì)稱性變差，拖尾較明顯，且水相比例過(guò)高易引起C18色譜柱固定相塌陷，導(dǎo)致柱效迅速下降，甚至縮短其使用壽命。因此，試驗(yàn)中流動(dòng)相比例為V（0.1%甲酸水溶液）∶V（甲醇）=90∶10，此條件下5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/L）的提取離子色譜圖如圖3所示。

圖2 不同流動(dòng)相比例下5-HMF的總離子流圖（標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度100 μg/L）

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖（100 μg/L）

2.4 前處理?xiàng)l件的選擇

HMF易溶于水、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等溶劑。為減少茶葉中脂溶性成分的溶出，試驗(yàn)采用純水作為提取溶劑，常溫下超聲提取?？疾觳煌崛r(shí)間對(duì)同一陽(yáng)性茶葉樣品中5-HMF的提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，樣品中5-HMF不斷溶出，12 min后基本平衡，為避免提取液中色素等雜質(zhì)的含量過(guò)高，將樣品的超聲提取時(shí)間定為12 min。

茶葉基質(zhì)較復(fù)雜，水溶性物質(zhì)主要有茶多酚、生物堿、氨基酸、糖類、芬香物質(zhì)等。近年來(lái)，不法商家為了追求茶葉的色澤亮麗，可能將茶葉人為染色[27]，使茶葉水提取液中基質(zhì)更加復(fù)雜。消除基質(zhì)效應(yīng)最關(guān)鍵的方法是樣品前處理時(shí)選擇有效的凈化方式，最大限度去除干擾組分。為準(zhǔn)確檢測(cè)5-HMF含量，減少基質(zhì)效應(yīng)，常用的凈化方法主要有固相萃取[18-19]及QuEChERS分散凈化技術(shù)[24]。QuEChERS法更適于用乙腈等作為提取溶劑，但茶葉用有機(jī)溶劑提取，雜質(zhì)溶出較多，凈化難度增加。因5-HMF易溶于水，試驗(yàn)選擇水作為提取溶劑。C18柱、陽(yáng)離子交換柱與HLB柱是常用于凈化復(fù)雜基質(zhì)中5-HMF的固相萃取柱。比較C18（60 mg，3 mL）、MCX（60 mg，3 mL）、HLB（60 mg，3 mL）3種小柱的凈化效果。結(jié)果表明，C18小柱凈化效果不佳，洗脫液顏色較深，且5-HMF損失較嚴(yán)重，這可能是因?yàn)橐苑菢O性吸附劑為填料的C18小柱對(duì)5-HMF的保留能力較弱；MCX（60 mg，3 mL）與HLB（60 mg，3 mL）經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化后，取5 mL提取液上樣、4 mL水淋洗、甲醇洗脫，2種柱子的洗脫液顏色均較深；將淋洗液改為5%氨水溶液，2種小柱中保留的色素不斷被洗脫，氨水溶液增加至2 mL后，流出液顏色變淺，加水淋洗至流出液呈中性，用甲醇洗脫，得到接近無(wú)色透明的洗脫液。計(jì)算5-HMF的回收率，HLB柱優(yōu)于MCX柱。

因此選擇HLB柱作為樣品凈化的固相萃取柱，5%氨水作為淋洗液，甲醇作為洗脫液。適當(dāng)增加洗脫液體積，5-HMF回收率不斷增大；洗脫液體積增加至8 mL，5-HMF回收率在90%以上，進(jìn)一步增大洗脫液體積，回收率沒有明顯改善。因此試驗(yàn)將洗脫液體積定為8 mL。洗脫液在45 ℃氮吹濃縮至近干，用1.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，以0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)5-HMF提取的影響

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

化學(xué)分析中，樣品中被分析物以外的組分對(duì)分析物的分析過(guò)程有干擾并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這種影響和干擾稱為基質(zhì)效應(yīng)（ME）。在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為：樣品中的干擾組分同待測(cè)物一同流出色譜柱，在離子源氣化發(fā)生庫(kù)倫爆炸變成小液滴直至產(chǎn)生氣體離子的過(guò)程中，這些干擾物質(zhì)會(huì)同待測(cè)物離子競(jìng)爭(zhēng)液滴表面，從而導(dǎo)致待測(cè)物的離子化效率降低或者增強(qiáng)，引起響應(yīng)降低或增高，最終影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般情況下，基質(zhì)效應(yīng)值在85%～115%不存在明顯基質(zhì)效應(yīng)[28]。采用相對(duì)響應(yīng)值法評(píng)價(jià)5-HMF的基質(zhì)效應(yīng)，根據(jù)樣品基質(zhì)溶液中5-HMF的響應(yīng)強(qiáng)度與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中5-HMF響應(yīng)強(qiáng)度的百分比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。取3份空白樣品，各0.5 g（檢測(cè)結(jié)果為陰性的綠茶和黑茶），按照1.5的方法進(jìn)行前處理，洗脫液于45 ℃氮吹濃縮至近干，分別加入1.4中質(zhì)量濃度10，50和100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，制成樣品基質(zhì)配標(biāo)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)6次（n=6）?；|(zhì)配標(biāo)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，通過(guò)記錄5-HMF的峰面積，計(jì)算樣品基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如表2所示。茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)值在88.2%～105.2%，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可忽略基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

2.6 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.6.1 方法的線性與檢出限

按照1.4的方法配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為y=5 255x+25 911，r2＞0.998，表明5-HMF在2～500μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。以信噪比（S/N）為3計(jì)算方法檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10計(jì)算方法定量限（LOQ），方法中5-HMF的LOD與LOQ分別為0.012和0.04 mg/kg，檢測(cè)靈敏度較高。

2.6.2 加標(biāo)回收率與精密度

茶的種類雖然數(shù)不勝數(shù)，但按制作工藝中是否進(jìn)行發(fā)酵可分為發(fā)酵茶與不發(fā)酵茶兩大類，其中綠茶為典型的不發(fā)酵茶，黑茶為發(fā)酵茶。試驗(yàn)選取1個(gè)綠茶、1個(gè)黑茶（檢測(cè)結(jié)果均為陰性）為樣本進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。2個(gè)樣本中的加標(biāo)量均為0.5，1.0和5.0mg/kg這3個(gè)水平，每個(gè)水平平行6次（n=6），進(jìn)行加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)，結(jié)果見表3。5-HMF回收率在81.1%～93.9%，日內(nèi)精密度（δRSD）在1.65%～ 5.82%。取加標(biāo)量1.0 mg/kg綠茶、黑茶樣品，連續(xù)測(cè)定3 d，分別評(píng)價(jià)其日間精密度，計(jì)算結(jié)果分別為5.01%和6.24%，符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求[29]，結(jié)果表明試驗(yàn)方法能準(zhǔn)確檢定茶葉中5-HMF。

表2 茶葉的基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

表3 加標(biāo)回收率與精密度

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取一陽(yáng)性茶葉樣品，平行稱取6份，按1.5的方法進(jìn)行前處理，在1.3的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果分別為0.56，0.57，0.56，0.52，0.54和0.57 mg/kg，其δRSD為3.41%，可見方法具有良好重復(fù)性。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用此次試驗(yàn)優(yōu)化的方法對(duì)抽檢的42批次茶葉樣品進(jìn)行5-HMF含量檢測(cè)，其中34批次樣品檢出5-HMF。34批次茶葉樣品包括不發(fā)酵茶與發(fā)酵茶，茶葉中5-HMF的含量大部分分布在0.1～1.0 mg/kg范圍內(nèi)；少部分茶葉中5-HMF含量超過(guò)1.0 mg/kg；極個(gè)別茶葉中5-HMF超過(guò)7.0 mg/kg，包括1個(gè)烏龍茶與紅茶樣品。檢測(cè)結(jié)果表明茶葉在加工儲(chǔ)存過(guò)程中很可能產(chǎn)生5-HMF，檢測(cè)和控制其含量具有重要意義。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)提取時(shí)間、質(zhì)譜參數(shù)、色譜分離條件和固相萃取前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，建立一種茶葉中5-HMF含量的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。方法在2～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好（r2＞0.998）；靈敏度高，取樣量0.5 g時(shí)，方法檢出限為0.012 mg/kg；準(zhǔn)確度高，樣品中加標(biāo)回收率在81.1%～93.9%。采用所建立的方法對(duì)茶葉樣品進(jìn)行測(cè)定，多種茶葉中檢出5-HMF，其生成機(jī)理還需深入探討。