劉猛 ，樊鳳嬌，劉新民，趙輝

1. 呂梁學院生命科學系（呂梁 033000）；2. 山西省特色植物功能成分工程研究中心（呂梁 033000）；3. 南京財經大學食品科學與工程學院（南京 210023）

核桃也稱為山核桃和胡桃，是一種醫(yī)藥與食用價值較高的油作物[1]，食用核桃可降低膽固醇吸收、降低心血管疾病的發(fā)病率等[2-6]。經研究，核桃蛋白中含有生物活性肽成分，具有吸收快、消耗低、數量多的特點[7-11]。因此開發(fā)核桃資源、研究核桃蛋白功能特性極為重要[12]。

易建華等[13]用蛋白酶水解核桃蛋白，得出復合酶對核桃蛋白作用明顯。姜莉等[14]采用胰蛋白酶酶解核桃蛋白，提取核桃中的多肽。崔莉等[15]研究溫度對核桃蛋白的影響，得出核桃蛋白具有熱敏性，其最適宜變性溫度為67.05 ℃，相比植物蛋白變性溫度較低。核桃蛋白在稀堿溶液中溶解性較好，且不溶于水，其等電點在pH 5左右，隨著溫度的升高，其溶解度增大，當溫度為55 ℃時，其溶解度達到最大。在略低于變性溫度，蛋白質的乳化能力及乳化穩(wěn)定性增加時，溫度也隨著升高[16]。齊西婷等[17]利用水劑法酶解中性蛋白酶中的核桃粗蛋白，以VC為對照進行試驗，分析核桃粗蛋白水解產物的體外抗氧化性。毛曉英[18]在核桃脫脂粉的溶解性分析中表明，核桃蛋白溶液中的溶解度較之于乙醇溶液中的溶解度略高。

試驗采用堿溶酸沉法提取核桃粕分離蛋白，通過單因素試驗研究酶解溫度、pH、酶解時間和酶添加量對核桃蛋白水解度的影響，采用正交試驗進行優(yōu)化，得到堿性蛋白酶水解核桃蛋白的最佳水解條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃粕（山西圣府第油脂有限公司）；堿性蛋白酶（北京奧博興生物技術有限公司）；鹽酸（福州飛凈生物科技有限公司）；甲醛溶液（天津市致遠化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（河南愛典化工有限公司）；PBS磷酸鹽緩沖液（杭州永星五交化有限公司）。

1.2 儀器與設備

PHBJ-260便攜式pH計（上海儀電科學儀器有限公司）；HH-6恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；TDL-40B高速離心機（湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司）；JD200-3電子天平（賽多利科學儀器有限公司）；85-1恒溫磁力攪拌器（金壇市普瑞斯機械有限公司）；H29527超聲提取器（北京恒奧德儀器有限公司）；EPOCH2型酶標儀（北京瑞利分析儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃蛋白的制備[19]

稱取100 g核桃粕于2 000 mL燒杯中，加2 000 mL蒸餾水，混勻，用1 mol/L NaOH調節(jié)pH至9.0，混勻，于50 ℃超聲提?。ǔ暪β?50 W）1 h，靜置30min，以3 000 r/min離心20 min，上清液用1 mol/L HCl調節(jié)pH至4.5，攪拌，靜置30 min，以3 000 r/min離心20 min，沉淀層用去離子水洗至中性，在3 000 r/min條件下離心20 min，冷凍干燥，即得核桃餅粕分離蛋白。

1.3.2 核桃蛋白酶解液蛋白質含量的測定

采用BCA法[20]測定蛋白質含量。

1.3.3 核桃蛋白水解度的測定

采用甲醛滴定法[21]測定水解度。取5 mL核桃蛋白水解液，加25 mL去離子水，恒溫磁力攪拌15 min，用0.05 mol/L NaOH標準溶液調整pH至8.2，加10 mL中性甲醛溶液，混勻，用0.05 mol/L NaOH溶液調整pH至9.2，記錄消耗的氫氧化鈉體積。另取30 mL去離子水，做空白試驗。試樣中氨基氮含量按式（1）計算。

式中：X為試樣中氨基氮含量，g/mL；V1為試樣中加入甲醛溶液后消耗NaOH標準液的體積，mL；V2為空白試驗加入甲醛溶液后消耗NaOH標準液的體積，mL；V3為試樣稀釋液用量，mL；C為試樣中NaOH標準液的濃度，mol/L；0.014為氮的毫克當量。

總氮量乘以氮的換算系數6.25為蛋白質含量。氨基氮含量與總氮含量的比值為水解度。

1.4 單因素試驗

1.4.1 酶解過程中溫度對核桃蛋白水解度的影響

分別取5 mL核桃分離蛋白溶液于5支試管中，加10 000 U/g堿性蛋白酶，調整pH至9.0，分別在溫度35，40，45，50和55 ℃條件下恒溫水解6 h。以蒸餾水代替核桃分離蛋白溶液為零管，記錄試驗數據。根據不同酶解溫度對核桃蛋白水解度的影響進行分析，得出最適的溫度。

1.4.2 酶解過程中pH對核桃蛋白水解度的影響

分別取5 mL核桃分離蛋白溶液于5支試管中，加10 000 U/g堿性蛋白酶，分別在pH 8，8.5，9，9.5和10，溫度50 ℃條件下恒溫水解6 h。以蒸餾水代替核桃分離蛋白溶液為零管，記錄試驗數據。根據不同pH對核桃蛋白水解度的影響進行分析，得出最適的pH。

1.4.3 酶解過程中時間對核桃蛋白水解度的影響

分別取5 mL核桃分離蛋白溶液于5支試管中，加10 000 U/g堿性蛋白酶，調整pH至9.0，分別在50 ℃恒溫水浴中分別水解3，4，5，6和7 h。以蒸餾水代替核桃分離蛋白溶液為零管，記錄試驗數據。根據不同酶解時間對核桃蛋白水解度的影響進行分析，得到最適的時間。

1.4.4 酶解過程中酶添加量對核桃蛋白水解度的影響

分別取5 mL核桃分離蛋白溶液于5支試管中，調整pH至9.0，加入堿性蛋白酶，加酶量分別為4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 U/g，于50 ℃恒溫水解6 h。以蒸餾水代替核桃分離蛋白溶液為零管，記錄試驗數據。根據不同酶添加量對核桃蛋白水解度的影響進行分析，得到最適的加酶量。

1.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，分別選取每個變量的3個最優(yōu)水平，按表1進行正交試驗，確定堿性蛋白酶對核桃蛋白的最佳水解條件。

表1 正交試驗設計

1.6 數據統(tǒng)計與分析

利用軟件記錄試驗數據，計算核桃蛋白的水解度，并用Origin軟件繪圖。正交試驗設計和結果采用正交設計助理IIV 3.1進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 核桃蛋白中蛋白質的含量的測定

BCA法測定蛋白質濃度標準曲線如圖1所示。線性回歸方程為y=0.897 37x+0.078 46，R2=0.996 78。

圖1 蛋白質標準曲線

2.2 溫度對核桃蛋白水解度的影響

如圖2所示，在35，40，45和50 ℃時，隨溫度的升高，水解度呈上升趨勢，在50 ℃時達到最高值，在50～55 ℃時逐漸趨于平緩。酶促反應與其他化學反應相同，隨溫度的升高，反應速率隨之增強。故核桃蛋白水解反應最適酶解溫度為50 ℃。

圖2 酶解溫度對核桃蛋白水解度的影響

2.3 pH對核桃蛋白水解度的影響

如圖3所示，隨pH的增加，水解度呈上升趨勢，達到最高點后緩慢下降，當pH為9時水解度達到最高值。過酸、過堿均造成酶空間結構的破壞，甚至使酶變性而喪失活力。由此得出核桃蛋白水解反應最適pH為9。

圖3 pH對核桃蛋白水解度的影響

2.4 酶解時間對核桃蛋白水解度的影響

如圖4所示，隨酶解時間的增加，水解度呈上升趨勢，在3～5 h時水解度隨時間增加而增大，在5～6 h時達到最高點，在6～7 h時水解度隨時間的增加呈平緩趨勢。由此得出核桃蛋白水解反應最適酶解時間為6 h。

圖4 酶解時間對核桃蛋白水解度的影響

2.5 酶添加量對核桃蛋白水解度的影響

如圖5所示。酶添加量在4 000～8 000 U/g時，水解度隨加酶量的增加而升高；當酶添加量為10 000 U/g時，水解度達到最高值；在10 000～12 000 U/g之間，水解度趨于平緩趨勢。由此得出核桃蛋白水解反應的最適加酶量為10 000 U/g。

圖5 酶添加量對核桃蛋白水解度的影響

2.6 正交試驗結果與分析

由表2可知，影響核桃蛋白水解的各因素主次順序為C＞D＞B＞A，即酶解時間＞酶添加量＞pH＞酶解溫度。根據正交試驗設計和結果可得5號A2B3C1D2為最優(yōu)方案，即核桃蛋白的最佳水解條件為酶解時間5 h、酶添加量10 000 U/g、pH 9.5、酶解溫度50 ℃；最佳水解度為21.2%。水解度越大，水解條越好。

表2 正交試驗結果和極差分析

由表3可知：當p＜0.05時，以酶解溫度為誤差項，經方差分析，得出酶解時間和酶添加量對核桃蛋白水解度的影響差異顯著，pH與溫度對其影響差異不顯著。

表3 正交試驗結果方差分析

3 結論

試驗采用堿溶酸沉法提取核桃粕核桃蛋白，用甲醛滴定法測定核桃蛋白的水解度，以水解度為指標，對不同酶解溫度、pH、酶解時間和酶添加量對水解度的影響進行單因素試驗，并通過正交試驗對其進行優(yōu)化。最終確定的核桃蛋白最佳水解條件為酶解時間5 h、酶添加量10 000 U/g、pH 9.5、酶解溫度45 ℃，其最佳水解度達到21.2%。試驗為核桃蛋白的深加工和利用、開發(fā)相關功能性食品提供一定的理論依據。