胡二坤，郭興鳳，鄭慧

1. 河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹飪食品與健康學(xué)院（鄭州 450046）；2. 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院（鄭州 450001）

人體的新陳代謝會(huì)產(chǎn)生很多自由基，這些自由基會(huì)破壞生物分子的結(jié)構(gòu)，改變其功能性質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷[1-2]。近年來，對(duì)天然活性物質(zhì)的抗氧化能力的研究越來越多。天然活性物質(zhì)的抗氧化活性評(píng)價(jià)的方法有很多，不同的方法有其特色和應(yīng)用范圍。目前，關(guān)于天然活性物質(zhì)抗氧化能力的評(píng)價(jià)方法主要有DPPH·清除率、超氧陰離子（O2-·）自由基清除率、羥自由基（·OH）清除率、還原力、抑制脂質(zhì)過氧化的能力等。

以魚蛋白水解產(chǎn)物和3個(gè)分離組分作為研究對(duì)象，分別以DPPH·清除率、羥自由基（·OH）清除率和還原力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)魚蛋白酶水解產(chǎn)物及3個(gè)分離組分的抗氧化活性。通過多指標(biāo)的評(píng)價(jià)，系統(tǒng)地研究魚蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

魚蛋白水解產(chǎn)物和分離產(chǎn)物：實(shí)驗(yàn)室自制。采用堿性蛋白酶（酶活3.0×105U/mL），在底物濃度18.05%、加酶量2.40%、水解pH 8.07、水解溫度48.84℃條件下進(jìn)行酶水解，酶解液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后制成粉末，即為魚蛋白水解產(chǎn)物。選用G-15葡聚糖凝膠作為柱材料分離純化魚蛋白水解產(chǎn)物，在上樣質(zhì)量濃度100 mg/mL、上樣體積2 mL、蒸餾水洗脫、洗脫速度2.0 mL/min的條件下分離純化魚蛋白水解產(chǎn)物，得到3個(gè)分離組分：組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ，3個(gè)分離組分的蛋白含量依次為83.70%，49.20%和36.91%，峰面積分別占51.70%，13.90%和34.40%。

DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

水楊酸、乙醇、三氯乙酸、氯化鐵、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、鹽酸、抗壞血酸、過氧化氫、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、茚三酮等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；AY120型分析天平，日本島津公司；722S可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；SHA-C型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇華峰儀器有限公司；SL型恒溫水浴鍋，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DPPH·清除率的測定

參照J(rèn)amdar等[3]的方法并稍作修改。取2 mL水解液，加入2 mL新配制的濃度1×10-4mol/L的DPPH溶液，搖勻，室溫避光條件下反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度。空白試樣為不加入樣品或DPPH溶液，分別用等體積無水乙醇代替。清除率按式（1）計(jì)算。

式中：Al為樣品組加入樣品和DPPH溶液時(shí)的吸光度；A2為空白組加入樣品，不加入DPPH溶液時(shí)的吸光度；A3為對(duì)照組不加樣品，加入DPPH溶液時(shí)的吸光度。

1.3.2 還原力的測定

還原力的測定參照Oyaizu[4]的方法并適當(dāng)修改，以普魯士藍(lán)的生成量為指標(biāo)，將鐵氰化鉀還原為Fe2+，再利用Fe2+形成普魯士藍(lán)，在700 nm下測定普魯士藍(lán)的生成量。取2 mL魚蛋白粉水解液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀后，在50 ℃條件下水浴反應(yīng)20 min，取出，迅速冷卻并加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)。取2.5 mL上述混合液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，充分混合后靜置10 min，在700 nm下測定吸光度，同時(shí)以蒸餾水代替樣品做空白試驗(yàn)。

1.3.3 羥自由基（·OH）清除率的測定

羥自由基清除率的測定方法基于水楊酸可以捕獲羥自由基（·OH）生成2, 3-二羥基苯甲酸和2, 5-二羥基苯甲酸，在510 nm處有最大吸收建立的一種用分光光度計(jì)檢測Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基的方法[5]。羥自由基（·OH）清除率的測定方法參照董銀萍等[6]的方法并做適合修改。取2 mL魚蛋白粉水解液，加入3 mL 1.8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，4 mL 1.8 mmol/L的FeSO4，最后加入0.2 mL 0.2% H2O2溶液啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min，在510 nm波長下測吸光度，同時(shí)做空白試驗(yàn)?！H清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A為樣品組加入魚蛋白粉水解液測得的吸光度；A0為空白組用蒸餾水代替魚蛋白粉水解液測得的吸光度。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用GraphPad、Origin 8.5、SPSS 16.0等軟件對(duì)所得相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有試驗(yàn)至少重復(fù)三次，結(jié)果取三次試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚蛋白水解產(chǎn)物及分離組分的DPPH·清除能力研究試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可以看出，魚蛋白水解產(chǎn)物和3個(gè)分離組分的DPPH·清除能力均隨著濃度的增大而增強(qiáng)。從圖1（a）中可以看出，在1.0～7.5 mg/mL時(shí)，隨著魚蛋白水解產(chǎn)物濃度的增加，其DPPH·清除率呈現(xiàn)顯著性增加（p＜0.05），當(dāng)魚蛋白水解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到47.0%。由圖1（b）可見，組分Ⅰ在質(zhì)量濃度為0.8～5.0 mg/mL時(shí)，其DPPH·清除率呈現(xiàn)顯著性增加，質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)，組分Ⅰ的DPPH·清除率為51.1%。組分Ⅱ的DPPH·清除能力由圖1（c）所示，在0.5～8.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，組分Ⅱ的DPPH·清除率顯著性增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，組分Ⅱ的DPPH·清除率為33.6%。組分Ⅲ的DPPH·清除率在0.4～4.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)顯著增加，當(dāng)組分Ⅲ質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，其DPPH·清除率59.7%。

圖1 魚蛋白水解產(chǎn)物及分離組分質(zhì)量濃度對(duì)DPPH·清除能力的影響

2.2 魚蛋白水解產(chǎn)物及分離組分還原能力研究試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可以看出，魚蛋白水解產(chǎn)物和3個(gè)分離組分的還原能力均隨著濃度的增加呈顯著性增加。由圖2（a）可見，魚蛋白水解產(chǎn)物在0.7～7.8 mg/mL濃度范圍內(nèi)，還原力呈現(xiàn)顯著性增加，當(dāng)魚蛋白水解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為4.3 mg/mL時(shí)，其還原力為0.450。圖2（b）為組分Ⅰ的還原能力隨濃度的變化趨勢，可以看出，在0.8～12.6 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，還原力呈現(xiàn)顯著性增加，當(dāng)組分Ⅰ質(zhì)量濃度為6.7 mg/mL時(shí)，其還原力為0.442。圖2（c）為組分Ⅱ的還原能力曲線圖，在1.0～14.8 mg/mL時(shí)，組分Ⅱ的還原力隨著質(zhì)量濃度的增大顯著性增加，當(dāng)質(zhì)量度濃度7.9 mg/mL時(shí)，其還原力為0.439。由圖2（d）可見，隨著組分Ⅲ在0.4～3.7mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增加，還原力呈現(xiàn)顯著性增加，當(dāng)組分Ⅲ質(zhì)量濃度為1.9 mg/mL時(shí)，其還原力為0.441。

圖2 魚蛋白水解產(chǎn)物及分離組分質(zhì)量濃度對(duì)還原力的影響

2.3 魚蛋白水解產(chǎn)物及分離組分·OH清除能力試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可以看出，魚蛋白水解產(chǎn)物和3個(gè)分離組分的·OH清除能力均隨著濃度的增加呈現(xiàn)顯著性增加。由圖3（a）可見，魚蛋白水解產(chǎn)物在0.4～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，·OH清除能力呈現(xiàn)顯著性增加，當(dāng)魚蛋白水解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時(shí)，其·OH清除率為56.3%。圖3（b）為組分Ⅰ的·OH清除能力隨濃度的變化趨勢，可以看出，在0.8～8.4 mg/mL濃度范圍內(nèi)，·OH清除能力呈現(xiàn)顯著性增加，當(dāng)組分Ⅰ質(zhì)量濃度為4.2 mg/mL時(shí)，其·OH清除能力為81.4%。圖3（c）為組分Ⅱ的·OH清除能力曲線圖，在0.01～2.00 mg/mL時(shí)，組分Ⅱ的·OH清除能力隨著濃度的增大顯著性增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)，其·OH清除能力為67.0%。由圖3（d）可見，隨著組分Ⅲ在0.4～3.7 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增加，·OH清除能力呈現(xiàn)顯著性增加，當(dāng)組分Ⅲ質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，其·OH清除能力為69.4%。

圖3 魚蛋白水解產(chǎn)物及分離組分質(zhì)量濃度對(duì)·OH清除能力的影響

2.4 魚蛋白酶水解產(chǎn)物及其分離純化組分IC50值比較研究試驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)魚蛋白水解產(chǎn)物及分離組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ進(jìn)行IC50的測定，結(jié)果見表1。

由表1分析出，魚蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)過分離純化，部分組分的抗氧化能力得到提高。其中組分Ⅰ的DPPH·清除能力得到提高，組分Ⅱ的·OH清除能力得到提高，組分Ⅲ的DPPH·清除能力和還原能力都得到了提高。組分Ⅲ的DPPH·清除能力和還原能力最強(qiáng)，其DPPH·清除能力的IC50值為1.43 mg/mL；還原力在吸光度為0.5時(shí)，質(zhì)量濃度為1.88 mg/mL。組分Ⅱ的·OH清除能力最強(qiáng)，IC50值為0.30 mg/mL。

表1 水解產(chǎn)物和分離組分的抗氧化能力測定結(jié)果單位：mg/mL

由于Fenton反應(yīng)生成·OH需要亞鐵離子的參與，魚蛋白和3個(gè)分離組分對(duì)·OH的清除作用可能是由于一方面酶解物與亞鐵離子結(jié)合，抑制了自由基的產(chǎn)生；另一方面是對(duì)已產(chǎn)生的羥自由基清除[7]。魚蛋白水解產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除作用是由于其可以向DPPH·提供電子或氫供體的疏水氨基酸暴露，使得魚蛋白水解產(chǎn)物具有清除DPPH·的能力[7]。魚蛋白水解產(chǎn)物提供電子或氫原子給自由基后，自身成為自由基中間體，中間體達(dá)到穩(wěn)定態(tài)的時(shí)間和穩(wěn)定態(tài)的穩(wěn)定程度直接影響最終的自由基清除能力。因此，可以認(rèn)為魚蛋白酶解物中小分子的肽段對(duì)清除自由基起了關(guān)鍵作用，這與莊永亮等[8]、Ko等[9]的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

魚蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)過分離純化后，部分組分的抗氧化能力發(fā)生了變化。其中組分Ⅰ和組分Ⅲ的DPPH·清除能力、組分Ⅱ的·OH清除能力和組分Ⅲ的還原能力均增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)組分中，組分Ⅲ的DPPH·清除能力和還原能力最強(qiáng)，其DPPH·清除能力的IC50值為1.43 mg/mL；還原力在吸光度為0.5時(shí)，質(zhì)量濃度為1.88 mg/mL。組分Ⅱ的·OH清除能力最強(qiáng)，IC50值為0.30 mg/mL。