梁瓊芳，唐小閑，湯泉，賴紹華

1. 賀州學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院（賀州 542899）；2. 食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院/廣西馬蹄加工工程技術(shù)研究中心（賀州 542899）

紅巧梅又名妃子紅，屬千日紅種，花色為艷麗的紅色[1-2]。紅巧梅具有一定藥用價(jià)值，可調(diào)節(jié)人體機(jī)能，清熱降火，祛斑美顏的功效，通常作為養(yǎng)生茶飲食用，以開水沖泡之，茶色為淡粉紅色，有清香。千日紅種色素基本為水溶性色素，可溶于水或乙醇，幾乎不溶于其他有機(jī)溶劑。紅巧梅色素以花色苷的形式存在，是一種天然色素[3-4]，具有安全性、無(wú)毒性，對(duì)人體有一定保健作用，在食品、化妝品、醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒂泻艽蟮陌l(fā)展前景[5]。隨著人類社會(huì)的進(jìn)步和物質(zhì)生活水平的提高，健康綠色的生活越來(lái)越注重關(guān)注，研究安全的食用天然色素是色素發(fā)展的重要方向，也是色素發(fā)展的必然趨勢(shì)。

色素通常采用普通浸提法、有機(jī)溶劑提取法、超聲波法提取法、微波提取法和酶法提取法。王自軍等[6]利用普通浸提法，黎彩平[7]分別對(duì)有機(jī)溶劑提取法和超聲波提取法提取千日紅色素進(jìn)行探究，利用超聲波法提取千日紅色素較普通浸提法和有機(jī)溶劑提取法來(lái)看，所耗時(shí)間較短，提取效率較高，但超聲波提取對(duì)設(shè)備有一定要求，且受超聲波衰減因素的影響，難以將超聲波提取技術(shù)工業(yè)化。徐忠等[8]利用酶法提取千日紅色素，雖然酶法提取色素較一般提取方法而言提取率更高，且環(huán)保節(jié)能，對(duì)設(shè)備要求不高，但過(guò)程復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果難以預(yù)測(cè)。微波輔助提取色素溶劑用量少，耗時(shí)短，效率高，在天然色素提取中占有重要的地位[9-11]。微波的加熱能量是直接由熱源傳遞至物質(zhì)，直接作用于細(xì)胞內(nèi)外，使細(xì)胞壁無(wú)法承受氣化壓力而破裂，細(xì)胞內(nèi)部的有效物質(zhì)擴(kuò)散到溶劑中[12-14]。因此采用微波輔助方式對(duì)紅巧梅色素進(jìn)行提取，探討提取條件及色素的穩(wěn)定性，促使自然資源得到合理有效的開發(fā)和應(yīng)用，積極響應(yīng)國(guó)家“可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略”的號(hào)召。

1 材料與方法

1.1 主要藥品

乙醇、三氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、過(guò)氧化氫、鹽酸、硝酸銅、硫酸鋁、氯化鈉、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水氯化鈣、硫代硫酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）。

1.2 主要儀器

A2004分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C精密pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；G80F20CN2L-B8（R0）光波微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）；V-1100D722可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司制造）；XFB-400高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠）；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)過(guò)程

1.3.1 預(yù)處理過(guò)程

將紅巧梅干花置于高速中藥粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)篩，得紅色紅巧梅干花粉末。

1.3.2 紅巧梅色素最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

取2.00 g紅巧梅干花粉末，在暗處室溫下浸提1 h，取適量色素提取液稀釋，在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，繪制光譜吸收曲線圖。

1.3.3 提取試驗(yàn)

取2.00 g紅巧梅干花粉末置于帶塞錐形瓶中，分別在不同提取劑、提取劑濃度、料液比、微波提取時(shí)間及火力下提取色素，將料液冷卻至室溫，抽濾，取色素提取液稀釋后，以相應(yīng)的提取劑作參比液，用可見分光光度計(jì)測(cè)樣品最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度，確定微波輔助提取紅巧梅色素的最優(yōu)條件。

1.3.4 色素的穩(wěn)定性研究

取2.00 g紅巧梅干花粉末，在最優(yōu)條件下用微波輔助提取紅巧梅色素。取色素提取液，分別在不同pH、不同光照強(qiáng)度、不同溫度及金屬離子、氧化劑與還原劑存在的情況下進(jìn)行試驗(yàn)。以相應(yīng)的提取劑作為參比液，用可見分光光度計(jì)測(cè)稀釋后的樣品在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度，以吸光度的變化為指標(biāo)探究各因素對(duì)紅巧梅色素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5 比較試驗(yàn)

取2份2.00 g紅巧梅干花粉末，分別用微波輔助法和有機(jī)溶劑提取法提取色素，對(duì)這2種提取方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅巧梅色素紫外光譜

紅巧梅色素紫外光譜如圖1。紅巧梅色素最大吸收波長(zhǎng)為520 nm。

圖1 紅巧梅色素紫外光譜

2.2 提取劑的選擇

取2.00 g紅巧梅干花粉末5份，分別加入60 mL蒸餾水、95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷，室溫下浸提1 h，觀察浸提液顏色。

由表1可知，紅巧梅色素為水溶性色素，不溶于丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，只溶于乙醇和蒸餾水。其原理遵循相似相溶定律，由于乙醇和水溶液中都具有—OH結(jié)構(gòu)，在紅巧梅花色素中同樣也具有—OH結(jié)構(gòu)，所以紅巧梅色素可溶于乙醇及水中，故選取乙醇和水溶液作為提取劑。

表1 提取劑的確定

2.3 提取劑濃度對(duì)色素提取的影響

取2.00 g紅巧梅干花粉末7份，分別加入60 mL蒸餾水、10%乙醇-水溶液、20%乙醇-水溶液、30%乙醇-水溶液、40%乙醇-水溶液、50%乙醇-水溶液、60%乙醇水溶液，微波火力70%，加熱45 s，待樣品冷卻后抽濾，取濾液。分別取9 mL樣品原液置于25 mL容量瓶中，稀釋至刻度線。在λ=520 nm處測(cè)樣品吸光度，其結(jié)果如圖2。

從圖2可以看出，微波加熱條件下，隨著乙醇-水溶液體積分?jǐn)?shù)增加，紅巧梅色素吸光度先增大后減小，乙醇-水溶液的體積分?jǐn)?shù)20%時(shí)達(dá)到最大值。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí)，色素?zé)o法完全溶出，故吸光度較小；乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，可能會(huì)使色素的性質(zhì)發(fā)生改變，并溶出一些雜質(zhì)，對(duì)提取過(guò)程造成影響。因此最佳微波提取體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇-水溶液。

圖2 提取劑的濃度對(duì)吸光度的影響

2.4 料液比對(duì)色素提取的影響

取2.00 g紅巧梅干花粉末6份，分別加入20，40，60，80，100和120 mL體積分?jǐn)?shù)20%乙醇-水溶液，微波火力70%，加熱45 s，待樣品冷卻后抽濾，取9 mL原液定容至25 mL，在λ=520 nm處測(cè)樣品吸光度，其結(jié)果如圖3。

從圖3可以看出，在微波提取條件下，紅巧梅色素的吸光度先增大后減小。料液比增大時(shí)，其下降趨勢(shì)較為明顯，料液比1∶20（g/mL）時(shí)，吸光度達(dá)到最大值。色素在同種提取劑中的溶解度是一定的，過(guò)量提取劑會(huì)對(duì)色素產(chǎn)生稀釋作用，色素濃度減小，則吸光度降低；過(guò)少的提取劑會(huì)使色素溶出不完全。故選取最佳料液比1∶20（g/mL）。

圖3 不同料液比對(duì)吸光度的影響

2.5 微波加熱火力對(duì)色素提取的影響

取2.00 g紅巧梅干花粉末6份，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)20%乙醇-水溶液，分別于20%，30%，40%，50%和60%微波火力下加熱45 s，待樣品冷卻后抽濾，取樣品原液9 mL定容至25 mL，在λ=520 nm處測(cè)樣品吸光度，其結(jié)果如圖4所示。

從圖4的數(shù)據(jù)可以看出，紅巧梅色素吸光度隨著微波火力提升先增大后減小，火力60%時(shí)達(dá)到最大值。其原因可能是隨著微波火力增加，料液溫度也在上升，料液達(dá)到一定溫度時(shí)，色素溶出量達(dá)到最大值；隨著溫度提升，高溫使提取出來(lái)的色素活性成分發(fā)生變質(zhì)。因此微波提取最佳火力為60%。

圖4 微波火力對(duì)吸光度的影響

2.6 微波加熱時(shí)間對(duì)色素提取的影響

取2.00 g紅巧梅干花粉末6份，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇-水溶液，在微波火力60%條件下分別加熱25，30，35，40，45和50 s，待樣品冷卻后抽濾，取樣品原液9 mL定容至25 mL，在λ=520 nm處測(cè)樣品吸光度，其結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，在微波火力60%，料液比1∶20（g/mL）條件下，微波加熱浸提紅巧梅干花粉末30 s得到色素吸光度最高，色素提取效果最好。

圖5 微波加熱時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.7 不同條件對(duì)紅巧梅色素穩(wěn)定性的影響

2.7.1 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

在最優(yōu)條件下提取紅巧梅色素。取紅巧梅干花粉末2.00 g，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)20%乙醇-水溶液，在微波火力60%條件下加熱30 s，待樣品冷卻后抽濾，取濾液，得紅巧梅色素原液。

取紅巧梅色素原液15 mL于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度線。調(diào)節(jié)pH后，在不同pH下，測(cè)量在λ=520 nm處樣品吸光度，其結(jié)果如表2所示。

紅巧梅色素在酸性和中性條件下吸光度與顏色變化不大，堿性條件下，吸光度與顏色變化很大。酸性及中性條件下，花色苷主要以花色烊陽(yáng)離子存在，顯紅色；在堿性條件下，花色苷中的羥基可能會(huì)發(fā)生縮合反應(yīng)，將羥基上的氧原子脫除，脫氧花色素為黃色。

表2 不同pH下的吸光度

2.7.2 不同光強(qiáng)對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

在最佳微波輔助提取條件下制取紅巧梅色素原液，將原液分成3份，分別置于強(qiáng)日光，室內(nèi)光，以及暗柜內(nèi)。每隔1 h測(cè)量在λ=520 nm處樣品吸光度，其結(jié)果如圖6所示。

色素在暗處的吸光度變化范圍不大；室內(nèi)光下與強(qiáng)日光照射下，隨著光照時(shí)間增加，吸光度呈下降趨勢(shì)，其中在強(qiáng)日光中吸光度下降趨勢(shì)較為明顯。即紅巧梅色素在光照條件下易分解，花色苷具有較大共軛體系，強(qiáng)光照射下，共軛體系不穩(wěn)定，花色苷容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，在光照下色素會(huì)分解。

圖6 不同光強(qiáng)對(duì)吸光度的影響

2.7.3 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別配制濃度0.01 mol/L的K+、Na+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe3+溶液，取10 mL在微波輔助提取條件下提取的紅巧梅色素原液，與金屬離子溶液按1∶1比例混合后，平行取3組5 mL混合液置于25 mL容量瓶中定容至刻度線。同時(shí)取10 mL色素原液，按1∶1比例與蒸餾水混合，并取5 mL原液與蒸餾水的混合液置于25 mL容量瓶中，定容至刻度線，作為空白對(duì)照樣。將樣品置于暗處，在λ=520 nm處測(cè)量水-紅巧梅色素原液混合液與金屬離子溶液-紅巧梅色素原液混合液在5，10和30 min的吸光度，其結(jié)果如表3。

在K+、Na+、Mg2+存在時(shí)紅巧梅色素的顏色及吸光度并無(wú)較大變化，即在此濃度下的K+、Na+、Mg2+對(duì)紅巧梅色素的穩(wěn)定性無(wú)明顯影響；Ca2+與Al3+存在時(shí)，紅巧梅色素的吸光度和顏色有略微的變化，即在此濃度下，Ca2+與Al3+對(duì)紅巧梅色素有輕微褪色作用；Cu2+、Fe3+離子存在時(shí)，紅巧梅色素的吸光度與顏色發(fā)生較大變化，因?yàn)樯刂谢ㄉ盏牧u基會(huì)與Cu2+、Fe3+離子結(jié)合生成金屬絡(luò)合物，會(huì)使色素的顏色發(fā)生改變。即在此濃度下的Cu2+、Fe3+對(duì)紅巧梅色素的穩(wěn)定性影響較大。

表3 不同金屬離子下的吸光度

2.7.4 氧化劑與還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別配制濃度2%，3%和4%的H2O2與Na2S2O3溶液，取適量與在微波輔助條件下提取的紅巧梅色素原液混合，設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組，將樣品置于暗處，在λ=520 nm處測(cè)量5 min，10 min，30 min，1 h和12 h吸光度，其結(jié)果如表4所示。

由表4可知，隨著氧化劑濃度的增加與時(shí)間增長(zhǎng)，紅巧梅色素的吸光度和顏色均發(fā)生較大變化，即紅巧梅色素在一定濃度氧化劑中不穩(wěn)定；但隨著還原劑濃度增加與時(shí)間增長(zhǎng)，紅巧梅色素的吸光度和顏色并未發(fā)生較大變化，即紅巧梅色素在一定濃度還原劑中可穩(wěn)定存在。

2.7.5 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

在最佳微波輔助提取條件下提取紅巧梅色素，將紅巧梅色素分別在不同溫度下回流1 h，其結(jié)果如表5所示。

紅巧梅色素在溫度30～40 ℃吸光度與顏色無(wú)明顯變化，色素穩(wěn)定性較好；50～60 ℃時(shí)，紅巧梅色素的吸光度與顏色略微變化，色素穩(wěn)定性開始變差；70～90 ℃時(shí)，紅巧梅色素的吸光度與顏色變化較大，因?yàn)榛ㄉ仗幱诟邷貤l件下，會(huì)分解成無(wú)色的查爾酮，使色素穩(wěn)定性變差。因此加熱可使紅巧梅色素分解，即紅巧梅色素的熱穩(wěn)定性較差。

表4 不同濃度氧化劑與還原劑下的吸光度

表5 不同溫度下的吸光度

2.7.6 有機(jī)溶劑提取法與微波輔助提取法比較試驗(yàn)

稱取2份2.00 g紅巧梅干花粉末，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)20%乙醇-水溶液。分別用微波輔助提取和有機(jī)溶劑提取。抽濾，稀釋測(cè)其在λ=520 nm的吸光度。其結(jié)果如表6所示。

在室溫下用有機(jī)溶劑提取法所提取的紅巧梅色素吸光度較用微波輔助提取法所提取的紅巧梅色素吸光度更低，且用有機(jī)溶劑提取法提取色素耗時(shí)更長(zhǎng)，微波輔助提取技術(shù)明顯更優(yōu)于普通有機(jī)溶劑提取法。

表6 有機(jī)溶劑與微波輔助提取吸光度對(duì)比

3 結(jié)論

1) 紅巧梅色素微波輔助提取的最優(yōu)條件是：以體積分?jǐn)?shù)20%乙醇-水溶液為提取劑，在料液比1∶20（g/mL），火力60%下微波提取45 s。

2) 紅巧梅色素為水溶性色素，其在酸性和中性條件下較為穩(wěn)定，能夠在一定濃度的還原劑中存在；在強(qiáng)日光下能維持短時(shí)間穩(wěn)定，之后色素便會(huì)發(fā)生變質(zhì)；溫度越高則紅巧梅色素穩(wěn)定性越差；除了Cu2+、Fe3+對(duì)色素的穩(wěn)定性有較大影響外，Ca2+與Al3+在一定濃度下對(duì)色素穩(wěn)定性有略微影響外其余離子無(wú)明顯影響。

3) 與有機(jī)溶劑提取法對(duì)比，微波輔助提取法耗時(shí)更短，提取效果更好，是一種非常有開發(fā)前景的色素提取方法。