狄飛達(dá)，鄭亭，紀(jì)芯鑰，劉一靜，涂彩虹，張馳松

1. 成都市農(nóng)林科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏研究所（成都 611130）；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院（成都 611130）；3. 四川旅游學(xué)院（成都 610110）

玫瑰（Rosa rugosa）作為我國一種悠久文化的美食原料，不僅有觀賞價(jià)值，還具有營養(yǎng)保健價(jià)值。玫瑰花中含有大量維生素、氨基酸、多酚黃酮、可溶性糖、生物堿、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，具有極強(qiáng)的抗氧化能力[1]，2010年國家衛(wèi)生部頒布相關(guān)法規(guī)將其納為食品，成為藥食兩用的食品之一。Zheng等[2]對(duì)中國常見的65種可食用花卉研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰花的多酚黃酮及抗氧化活性均為第一，肖麗宏等[3]發(fā)現(xiàn)云南墨紅玫瑰色素粗提物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞活性有較強(qiáng)抑制能力，具有較好體外抗氧化活性。因此，玫瑰花在食品工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用前景。

然而，玫瑰花產(chǎn)品開發(fā)主要集中在玫瑰花茶[4]、玫瑰花酒[5]、玫瑰果醬[6]等；針對(duì)玫瑰花多酚黃酮的優(yōu)化試驗(yàn)多以醇溶液為研究對(duì)象[7]，雖然提取率較高，但實(shí)際生產(chǎn)成本也較高，不利于后期食品加工直接使用。生物酶解技術(shù)具有提高果蔬汁澄清度和提取率的優(yōu)點(diǎn)，并且反應(yīng)體系溫和，應(yīng)用范圍較為廣泛[8]。因此，以新鮮墨紅玫瑰花為原料，探討復(fù)合酶種類、酶活比及料水比對(duì)提取玫瑰多酚黃酮含量的影響，在此基礎(chǔ)上通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察雙酶活添加量、酶解溫度、pH、酶解時(shí)間等因素對(duì)玫瑰花多酚黃酮的影響并評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為玫瑰花實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花（云南紅河產(chǎn)地，品種為墨紅，要求完整、無蟲蛀、無霉變、無腐爛采后立即于10 ℃下預(yù)冷2 h，放入-30 ℃冰箱中速凍，貯藏在-20 ℃冰箱）；果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶（食品級(jí)，南寧龐博生物工程有限公司）；檸檬酸、碳酸氫鈉（食品級(jí)，山東福田藥業(yè)有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）、羥自由基（·OH）（索萊寶公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋（HH-S，天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠）；低速離心機(jī)（D5B，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；無油隔膜真空泵（HP-01，上海力辰邦西儀器科技有限公司）；打漿機(jī)（HR3868，荷蘭皇家飛利浦公司）；pH計(jì)（CT-6023，北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司）；電子天平（AUY220，SHIMADZU（島津）公司）；手持色差儀（CR-400，柯尼卡美能達(dá)控股公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玫瑰花提取液工藝流程

1.3.1.1 工藝流程

預(yù)處理→護(hù)色預(yù)榨汁→保溫調(diào)節(jié)pH→加入復(fù)合酶酶解→滅酶離心→抽濾成品

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

預(yù)處理：將玫瑰花放置于4 ℃冰箱解凍5 min，清洗瀝干。

護(hù)色預(yù)榨汁：將解凍的玫瑰花與4 ℃冰水按照一定料水比配制，加入0.05%蘋果酸、0.05%檸檬酸進(jìn)行護(hù)色打漿8 s[9]。

保溫調(diào)節(jié)pH：將打漿后的玫瑰汁保溫，并調(diào)節(jié)適當(dāng)pH。

加入雙酶酶解：添加一定量雙酶，并放入振蕩培養(yǎng)箱酶解。

滅酶離心：將反應(yīng)好的玫瑰花提取液95 ℃滅菌10 min，并在4 000 r/min條件下離心15 min。

抽濾成品：將離心后的上清液抽濾過0.45 μm濾膜得到澄清的玫瑰花提取液。

1.3.2 雙酶活比例的確定

稱取10.0 g玫瑰花，在料水比1∶20（g/mL）、酶解溫度45 ℃、pH 3.5、酶活添加量800 U/g條件下酶解180 min，研究不同單一酶（果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶）及不同雙酶活比對(duì)玫瑰花多酚黃酮含量的影響。

1.3.3 料水比的選擇

在m（果膠酶）∶m（木聚糖酶）=1∶2條件下，其他條件同1.3.2，考察不同料水比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL））對(duì)玫瑰花多酚黃酮含量的影響。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

稱取10.0 g玫瑰花，在料水比1∶20（g/mL）、雙酶為m（果膠酶）∶m（木聚糖酶）=1∶2條件下，考察雙酶活添加量（200，400，600，800，1 000，1 200和1 400 U/g），酶解溫度（30，35，40，45，50，55和60 ℃），酶解時(shí)間（30，60，90，120，150，180和210 min），pH（2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0）4個(gè)因素對(duì)玫瑰花多酚黃酮含量的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇雙酶活添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）、酶解時(shí)間（D）為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)，以提高酶解玫瑰花提取液多酚黃酮含量。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4 試驗(yàn)測定方法

1.4.1 多酚測定方法

參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[10]及文獻(xiàn)[11]，略有修改，采用Folin-Ciocalteu比色法測定玫瑰花及花汁多酚含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，取質(zhì)量濃度0.008～0.040 mg/mL沒食子酸各1 mL，加入5 mL 10%福林酚試劑，反應(yīng)8 min后加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液，室溫下避光放置60 min后于765 nm波長條件下用分光光度計(jì)測定吸光度，以蒸餾水代替標(biāo)液為空白對(duì)照繪制標(biāo)曲，得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度y（mg/mL）與吸光度x的回歸方程為y=11.037x-0.001 5（R2=0.999 2）計(jì)算玫瑰花提取液中的多酚含量，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量（GAE）表示，單位為mg/mL。測定玫瑰花提取液時(shí)，取1 mL玫瑰花澄清汁定容到100 mL，搖勻按照上述方法測定。玫瑰花提取液中的總酚含量以每克玫瑰花中所含的總酚（mg/g，以GAE計(jì)）含量計(jì)。

1.4.2 黃酮測定方法

參考文獻(xiàn)[12]，略有修改，采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度計(jì)法測定玫瑰花及花汁的總黃酮含量。配置0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取0，0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00和6.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 mL比色管，用60%乙醇補(bǔ)充至15 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻后放置反應(yīng)6 min，加入1.5 mL 10%硝酸鋁溶液搖勻放置6 min，加入4 mL 10%氫氧化鈉溶液，并用60%乙醇定容到25 mL，搖勻反應(yīng)15 min后在波長510 nm處測定吸光度，吸光度，以蒸餾水代替樣品溶液做空白對(duì)照，得到蘆丁質(zhì)量濃度y（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為y=0.011 3x+0.001 3（R2=0.999 4）算樣品中的總黃酮含量，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量（RE）表示，單位為mg/mL。測定玫瑰花提取液時(shí)，取10 mL玫瑰花澄清汁定容到100 mL，搖勻按照上述方法測定，玫瑰花提取液中的總黃酮含量以每克玫瑰花中所含的黃酮（mg/g，以RE計(jì)）含量計(jì)。

1.4.3 色差值測定方法

通過手持色差儀，從L*、a*、b*驗(yàn)證判斷最優(yōu)玫瑰澄清汁成色效果。采用食品工業(yè)中常用的國際照明委員會(huì)（CIE）推薦的L*、a*、b*。L*值表示亮度，又稱白度值（白～黑），L*越大亮度越大；a*值又稱紅度值，表示有色物質(zhì)的紅綠偏向，正值越大偏向紅色的程度越大，負(fù)值絕對(duì)值越大偏向綠色的程度越大；b*值又稱為黃度值，表示有色物質(zhì)的黃藍(lán)偏向，正值越大偏向黃色的程度越大，負(fù)值絕對(duì)值越大偏向藍(lán)色的程度越大。

1.4.4 玫瑰花提取液抗氧化活性測定方法1.4.4.1 DPPH·清除率的測定

參考文獻(xiàn)[13]，略有改動(dòng)，配制0.5～50 mg GAE/g濃度提取液，準(zhǔn)確移取待測樣品液1.0 mL于試管中，加入1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液。以2.0 mL蒸餾水作為空白、1.0 mL DPPH溶液與1 mL蒸餾水混合液作為對(duì)照，振搖混勻后進(jìn)行避光保存30 min，在517 nm處測定吸光度。DPPH·清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A為樣品吸光度；A0為對(duì)照組吸光度。

1.4.4.2 ·OH清除率的測定

參考文獻(xiàn)[3]，略有改動(dòng)，配制0.5～50 mg GAE/g濃度提取液，準(zhǔn)確移取待測樣品液1.0 mL于試管中，依次加入1.0 mL 0.15 mol/L硫酸亞鐵溶液、2 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，加入1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液，振搖混勻放入37 ℃水浴鍋中水浴30 min，放置冷卻后在510 nm處測定樣品的吸光度。用蒸餾水對(duì)H2O2和樣品進(jìn)行替換，510 nm波長處測定相應(yīng)的吸光度?！H清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A1為樣品吸光度；A2為用蒸餾水替換H2O2后測得對(duì)應(yīng)吸光度；A0為蒸餾水替換樣品后測的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄，Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，SPSS進(jìn)行Duncan（p＜0.05）法比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花多酚黃酮含量

試驗(yàn)采用的玫瑰花是云南墨紅玫瑰品種，含水量82.5%±1.1%，多酚含量70.2±1.4 GAE mg/g（以鮮重計(jì)算），總黃酮含量35.1±2.3 RE mg/g（以鮮重計(jì)算），與Zheng等[2]研究數(shù)據(jù)較為一致。

2.2 單一酶解種類、雙酶活比例的確定

酶解技術(shù)具有提高果蔬汁澄清度、活性成分等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于果蔬加工，其中比較常用的有果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶等[14]。不同酶制劑對(duì)玫瑰花多酚黃酮含量的影響如圖1所示。果膠酶、木聚糖酶均能顯著提高玫瑰花提取液的多酚和總黃酮含量，分別達(dá)到43.65 mg/g，21.70 mg/g和40.22 mg/g，21.93 mg/g。

圖1 單一酶種類對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

在實(shí)際生產(chǎn)中，為進(jìn)一步提高果蔬汁產(chǎn)品質(zhì)量，常采用復(fù)合酶制劑處理果蔬汁[15]，在單一酶制劑試驗(yàn)基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)果膠酶、木聚糖酶不同酶活比對(duì)于玫瑰花提取液多酚黃酮的含量均有一定影響，由圖2可知，酶活比（m（果膠酶）∶m（木聚糖酶））=1∶2時(shí)玫瑰花提取液多酚黃酮含量最高，此處理下，多酚和總黃酮含量相比于未經(jīng)酶處理均提高約25%，結(jié)合圖1分析可知，相比于單一酶處理提高約15%。故選擇最佳雙酶活比例1∶2。

2.3 料水比的選擇

酶解反應(yīng)中，料水比大小會(huì)影響酶與底物接觸程度及溶質(zhì)的擴(kuò)散速率[16]，不同料液比對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響如圖3所示。料水比1∶20（g/mL）時(shí)，玫瑰花提取液多酚黃酮含量最高，分別為48.84和21.84 mg/g。因此選擇最佳料水比1∶20（g/mL）。

圖2 雙酶比例對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

圖3 料水比對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4 單因素對(duì)玫瑰花提取液玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4.1 雙酶活添加量對(duì)玫瑰花提取液玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

復(fù)合酶活在一定條件下添加量越多，細(xì)胞壁降解程度越大，活性成分溶出也會(huì)越多[17]。由圖4可知，隨著雙酶活添加量增加，玫瑰花提取液多酚黃酮含量逐漸增加，添加量800 U/g時(shí)達(dá)到最高。因此選擇最佳雙酶活添加量800 U/g。

圖4 雙酶活添加量對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4.2 酶解溫度對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

酶解反應(yīng)中，不同的酶制劑具有不同的最適酶活反應(yīng)溫度，并且溫度也會(huì)影響底物擴(kuò)散，設(shè)置不同酶解溫度進(jìn)行測試，以確定最佳酶解溫度。由圖5可知，酶解溫度為30～45 ℃時(shí)，玫瑰花提取液多酚黃酮含量逐漸升高，此后隨著溫度升高，含量逐漸降低，這是由于反應(yīng)溫度過高會(huì)破壞酶結(jié)構(gòu)，并且溫度過高會(huì)導(dǎo)致多酚降解[18]。因此選擇最適酶解溫度45 ℃。

圖5 酶解溫度對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4.3 酶解pH對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

不同pH環(huán)境下，酶所表現(xiàn)的活力不一樣，酶解率也不同。由圖6可知，隨著pH增大，多酚含量逐漸增加，且在pH 3.5時(shí)增加幅度最大，隨后緩慢增加；黃酮含量在pH 3.5時(shí)達(dá)到最高值。此外，pH＞3.5時(shí)，玫瑰花提取液顏色偏橙黃色，這是由于玫瑰花色苷可能存在4種結(jié)構(gòu)形式：醌式結(jié)構(gòu)（藍(lán)色）、2-苯基苯并吡喃陽離子（紅色）、醇型假堿（無色）和查爾酮結(jié)構(gòu)（無色），在pH 4～5時(shí)，溶液可能是有較多無色的醇型假堿和查爾酮結(jié)構(gòu)存在，導(dǎo)致提取液顏色由紅色向橙黃色轉(zhuǎn)變[19]。因此，綜合色澤考慮，選擇最佳酶解pH 3.5。

圖6 酶解pH對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.4.4 酶解時(shí)間對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

由圖7可知，隨著酶解時(shí)間延長，玫瑰花提取液多酚黃酮含量逐漸增加，但超過180 min時(shí)，延長時(shí)間對(duì)多酚含量提升效果不顯著，這是由于隨著酶解時(shí)間增加，細(xì)胞壁破壞程度越高，達(dá)到臨界值以后，其細(xì)胞內(nèi)溶出物趨于最大化，因此綜合考慮生產(chǎn)效率，酶解時(shí)間選用180 min。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)玫瑰花提取液多酚黃酮含量的影響

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)后結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，各因素對(duì)于多酚含量的影響順序?yàn)锳＞D＞B＞C，即雙酶活添加量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度＞酶解pH；各因素對(duì)黃酮含量的影響順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即雙酶活添加量＞酶解pH＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。分析得出，酶解提取多酚最優(yōu)工藝為A2B1C3D3，酶解提取黃酮最優(yōu)工藝為A2B1C2D3，而A2B1C3D3并未出現(xiàn)在試驗(yàn)組合中，故對(duì)該組合進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 正交驗(yàn)證試驗(yàn)及抗氧化活性分析

對(duì)正交試驗(yàn)確定的兩組最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并與未進(jìn)行酶解處理的玫瑰花提取液進(jìn)行對(duì)比，玫瑰花提取液的多酚黃酮含量、色差、抗氧化活性結(jié)果見表3。

由表3可知，A2B1C2D3與A2B1C3D3處理后的玫瑰澄清汁多酚黃酮含量相近，其并均優(yōu)于未酶解處理的玫瑰花提取液，提高約50%。通過色差感官表明，A2B1C3D3組合a*值低于A2B1C2D3組合，此時(shí)，玫瑰澄清汁前者偏橙黃色，而后者呈現(xiàn)橙紅色，具有更好的感官品質(zhì)，該組合玫瑰花提取液的DPPH·及·OH清除率顯著高于未酶解處理玫瑰花提取液，分別達(dá)到93.21%及84.31%。故而試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B1C2D3，即雙酶活添加量800 U/g，酶解溫度40 ℃，酶解pH 3.5，酶解時(shí)間210 min。

表3 優(yōu)化后玫瑰花提取液多酚黃酮、色差及抗氧化活性結(jié)果

2.7 玫瑰花提取液體外抗氧化活性分析

由圖8可知，在0.5～50 mg GAE/g濃度范圍內(nèi)，玫瑰花提取物對(duì)DPPH·清除能力與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系，玫瑰花提取物濃度大于10 mg GAE/g后，其對(duì)DPPH·清除能力緩慢上升。根據(jù)IC50值可以確定清除自由基能力的強(qiáng)弱[20]，試驗(yàn)中，玫瑰花提取物清除DPPH·的IC50約1 mg GAE/g。

由圖9可知，在0.5～50 mg GAE/g濃度范圍內(nèi)，玫瑰花提取物對(duì)·OH清除能力與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。根據(jù)數(shù)據(jù)可知，玫瑰花提取物清除·OH的IC50約1.5 mg GAE/g。

圖8 玫瑰花提取物濃度對(duì)DPPH·清除率的影響

圖9 玫瑰花提取物濃度對(duì)·OH清除率的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)確定雙酶法酶制備富含多酚總黃酮玫瑰花提取液的最佳工藝：雙酶活添加量（m（果膠酶）∶m（木聚糖酶）=1∶2）800 U/g，酶解溫度40 ℃，酶解pH 3.5，酶解時(shí)間210 min，按照此工藝制得的玫瑰花提取液多酚含量為53.15 mg/g（以GAE計(jì)），總黃酮含量為28.32 mg/g（以RE計(jì)），相對(duì)于未酶解處理提高約50%。具有玫瑰典型的柔紅色澤，玫瑰花提取液的DPPH·及·OH清除率分別達(dá)到93.21%及84.31%，并且通過對(duì)不同濃度的玫瑰提取液研究表明，其提取液具有良好抗氧化活性。因此，采用雙酶法工藝制備富含多酚黃酮的玫瑰花提取液可行穩(wěn)定，可作為玫瑰花液態(tài)健康食品的生產(chǎn)原料，對(duì)于玫瑰花的綜合利用提供思路。