丁偉，田莉，閆裕峰，郎繁繁，梁楷，張思敏

1. 山西紫林醋業(yè)股份有限公司（太原 030400）；2. 山西省食品工業(yè)研究所（太原 030024）

酸、甜、苦、咸是人體的四種基本味覺[1]，其中以酸居首位，而日常生活中提供酸味的調(diào)味品絕大多數(shù)被食醋所包攬，由此可見食醋在人們?nèi)粘Ｉ钪械牡匚恢?。山西老陳醋以高粱、麩皮為主要原料，大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)“蒸、酵、熏、淋、陳”等工序釀制而成，具有“酸、綿、甜、香、鮮”的風(fēng)味特征，居四大名醋之首[2-5]。

制醋先制酒，好酒出好醋，酒精發(fā)酵工藝是老陳醋制作的基礎(chǔ)工序，酒醪品質(zhì)的好壞直接影響老陳醋的質(zhì)量[6-8]。傳統(tǒng)的老陳醋酒精發(fā)酵工藝以大曲為糖化發(fā)酵劑，大曲富含自然界的多種微生物，發(fā)酵產(chǎn)酒的同時(shí)能賦予酒醪多種風(fēng)味物質(zhì)。但大曲生產(chǎn)過程是自然接種，氣候和環(huán)境等因素對其微生物種類、數(shù)量及質(zhì)量有較大影響，因而容易造成生產(chǎn)批次間的較大差異，且發(fā)酵時(shí)間較長，不利于產(chǎn)量和質(zhì)量的穩(wěn)定[9-13]。

安琪復(fù)合菌（簡稱復(fù)合菌）由多種微生物菌種復(fù)合培養(yǎng)而成，通過合理使用，穩(wěn)定酒醪酒精度的同時(shí)能顯著增加酒精發(fā)酵階段的風(fēng)味物質(zhì)含量，提高酒醪質(zhì)量。

氨基酸態(tài)氮是國家標(biāo)準(zhǔn)中限定最低含量的一個(gè)指標(biāo)，其能為食醋提供特殊的鮮味[14-15]。試驗(yàn)以糧水比、大曲添加量、復(fù)合菌添加量和發(fā)酵時(shí)間為考察因素，以酒精度與氨基酸態(tài)氮為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以酒醪酒精度和氨基酸態(tài)氮為考察指標(biāo)，得到安琪復(fù)合菌應(yīng)用于傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵的最佳工藝條件，可為傳統(tǒng)老陳醋生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

高粱（市售）；大曲（山西紫林醋業(yè)股份有限公司自制）；安琪復(fù)合菌（安琪酵母股份有限公司）；甲醛、氫氧化鈉（分析純，天津歐博凱化工有限公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ALKOMAT酒精檢測儀：福林斯（徐州）生化技術(shù)有限公司；AR124CN電子天平、ZL-002 pH計(jì)（奧豪斯儀器有限公司）；78-1型磁力電熱攪拌器（江蘇榮華儀器制造有限公）司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 安琪復(fù)合菌應(yīng)用于傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：選取飽滿、無雜質(zhì)、無霉變的高粱，粉碎后用50 ℃的溫水潤料12 h，然后蒸熟、攤涼、冷卻至30 ℃，加入大曲和復(fù)合菌拌勻，轉(zhuǎn)入發(fā)酵缸，加一定比例的水?dāng)嚢杈鶆蚝箝_始發(fā)酵。前3 d為敞口發(fā)酵，其后封缸密閉發(fā)酵。

1.2.2 安琪復(fù)合菌應(yīng)用于傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

糧水比的確定：以高粱用量為參照，選取糧水比1∶1.0，1∶2.0，1∶3.0，1∶4.0和1∶5.0（kg/kg），大曲添加量50%，復(fù)合菌添加量0.30%，發(fā)酵時(shí)間16d，進(jìn)行老陳醋酒精發(fā)酵，以酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒醪的酒精度及氨基酸態(tài)氮含量為檢測指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

大曲添加量的確定：以高粱用量為參照，選取糧水比1∶4.0（kg/kg），大曲添加量30%，40%，50%，60%和70%，復(fù)合菌添加量0.30%，發(fā)酵時(shí)間16 d，進(jìn)行老陳醋酒精發(fā)酵，以酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒醪的酒精度及氨基酸態(tài)氮含量為檢測指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

復(fù)合菌添加量的確定：以高粱用量為參照，選取糧水比1∶4.0（kg/kg），大曲添加量為50%，復(fù)合菌添加量0.00%，0.10%，0.20%，0.30%和0.40%，發(fā)酵時(shí)間16 d，進(jìn)行老陳醋酒精發(fā)酵，以酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒醪的酒精度及氨基酸態(tài)氮含量為檢測指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

發(fā)酵時(shí)間的確定：以高粱用量為參照，選取糧水比1∶4.0（kg/kg），大曲添加量50%，復(fù)合菌添加量0.30%，發(fā)酵時(shí)間10，12，14，16和18 d，進(jìn)行老陳醋酒精發(fā)酵，以酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒醪的酒精度及氨基酸態(tài)氮含量為檢測指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 安琪復(fù)合菌應(yīng)用于傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵工藝響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以糧水比（A）、大曲添加量（B）、復(fù)合菌添加量（C）及發(fā)酵時(shí)間（D）為試驗(yàn)因素，以酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒醪的酒精度（Y1）及氨基酸態(tài)氮含量（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，進(jìn)行老陳醋酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 酒精度測定

取100 mL發(fā)酵結(jié)束時(shí)的酒醪，加100 mL蒸餾水，用容量瓶收集100 mL蒸餾液，用ALKOMAT酒精檢測儀測定酒精度。

1.2.5 氨基酸態(tài)氮含量測定

按照GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》[14]進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

運(yùn)用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 19.0進(jìn)行單因素分析，Design-Expert.V 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 糧水比對老陳醋酒精發(fā)酵的影響

由表2可知，當(dāng)糧水比為1∶3.0（kg/kg）與1∶4.0（kg/kg）時(shí)，老陳醋酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒醪的酒精度與氨基酸態(tài)氮含量均極顯著高于其他比例的結(jié)果（p＜0.01），且二者間差異不顯著（p＞0.05），這表明糧水比過低或過高均不利于酒醪各指標(biāo)的提高，原因可能是當(dāng)糧水比過低時(shí)，醪液濃稠度過高，流動(dòng)性降低，微生物活動(dòng)受限，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，使得相關(guān)理化指標(biāo)難以提高；當(dāng)糧水比過高時(shí)，醪液被稀釋，從而使相關(guān)理化指標(biāo)降低。因此，最佳糧水比為1∶4.0（kg/kg）。

表2 糧水比對老陳醋酒精發(fā)酵的影響

2.1.2 大曲添加量對老陳醋酒精發(fā)酵的影響

大曲是一種常見的糖化發(fā)酵劑，含有多種復(fù)雜的微生物，能將原料中的淀粉經(jīng)過液化、糖化及酒精發(fā)酵最終轉(zhuǎn)化為酒精，也能分解部分蛋白質(zhì)累物質(zhì)[16-18]。由表3可知，當(dāng)大曲添加量從30%增加到60%時(shí)，酒醪的酒精度與氨基酸態(tài)氮含量均極顯著增加（p＜0.01）；當(dāng)大曲添加量繼續(xù)增加到70%時(shí)，酒醪的酒精度與氨基酸態(tài)氮含量無顯著變化（p＞0.05）。因此，大曲的最適添加量為60%。

表3 大曲添加量對老陳醋酒精發(fā)酵的影響

2.1.3 復(fù)合菌添加量對老陳醋酒精發(fā)酵的影響

安琪復(fù)合菌含有多種高純度的強(qiáng)化復(fù)合菌種，能增加酒精發(fā)酵階段風(fēng)味物質(zhì)（氨基酸態(tài)氮）的含量。由表4可知，當(dāng)復(fù)合菌添加量從0.00%增加到0.30%時(shí)，酒醪的酒精度與氨基酸態(tài)氮含量均極顯著增加（p＜0.01）；當(dāng)復(fù)合菌添加量繼續(xù)增加到0.40%時(shí)，酒醪的酒精度與氨基酸態(tài)氮含量無顯著變化（p＞0.05）。因此，復(fù)合菌的最適添加量為0.30%。

表4 復(fù)合菌添加量對老陳醋酒精發(fā)酵的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對老陳醋酒精發(fā)酵的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵前3 d，酒醪酒精度基本達(dá)到最大值，后期主要是養(yǎng)醪階段，以增加風(fēng)味物質(zhì)含量[19-21]。由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從3 d增加到16 d時(shí)，酒醪的酒精度變化不明顯，而氨基酸態(tài)氮含量極顯著增加（p＜0.01），當(dāng)發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)增加到18 d時(shí)，酒醪的酒精度和氨基酸態(tài)氮含量均開始降低。因此，最適發(fā)酵時(shí)間為16 d。

2.2 傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

使用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對表5的結(jié)果進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到酒精度（Y1）及氨基酸態(tài)氮（Y2）的二次多項(xiàng)回歸方程：

圖1 發(fā)酵時(shí)間對老陳醋酒精發(fā)酵的影響

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表6可知，以酒精度為響應(yīng)值構(gòu)建的模型的p＜0.000 1，達(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)的p=0.059 9＞0.05，不顯著，故試驗(yàn)不存在失擬因素，可反映實(shí)際情況，所選模型適宜。決定系數(shù)R2=98.68%，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=97.37%，表明回歸模型能良好擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，模型可靠，可用來分析和預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)方差分析結(jié)果可知，模型中的一次項(xiàng)A、D及二次項(xiàng)A2、D2對結(jié)果影響極顯著（p＜0.01），其他項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著（p＞0.05）。根據(jù)回歸方程得到各因素間的交互作用對酒精度影響的響應(yīng)曲面及等高線，見圖2。響應(yīng)曲面的圖形坡度越陡峭，代表該因素對酒精度的影響越大，反之，坡度平緩則表明影響較小。由圖2可知，影響酒精度的各因素主次順序?yàn)榧Z水比＞發(fā)酵時(shí)間＞復(fù)合菌用量＞大曲用量，與表6的方差分析結(jié)果一致。

由表6可知，以氨基酸態(tài)氮為響應(yīng)值構(gòu)建的模型的p＜0.000 1，極顯著。失擬項(xiàng)p=0.331 3＞0.05，不顯著。決定系數(shù)R2=95.60%，校正決定系數(shù)R2Adj=91.19%，表明擬合程度良好，可用此模型對該試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測。方差分析結(jié)果顯示，一次項(xiàng)A、C與二次項(xiàng)A2、B2對結(jié)果影響極顯著（p＜0.01），一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB對結(jié)果影響顯著（p＜0.05），其他項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著（p＞0.05）。各影響因素交互作用的響應(yīng)面曲線見圖3。各因素對氨基酸態(tài)氮影響的主次順序?yàn)榧Z水比＞復(fù)合菌用量＞大曲用量＞發(fā)酵時(shí)間，與表6的方差分析結(jié)果一致。

表6 回歸方程方差分析

圖2 糧水比、大曲添加量、復(fù)合菌添加量和發(fā)酵時(shí)間對酒精度影響的響應(yīng)曲面與等高線

圖3 糧水比、大曲添加量、復(fù)合菌添加量和發(fā)酵時(shí)間對氨基酸態(tài)氮影響的響應(yīng)曲面與等高線

運(yùn)用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件，通過響應(yīng)面法分析試驗(yàn)，求得酒精度（Y1）及氨基酸態(tài)氮（Y2）的二次多項(xiàng)回歸方程的最優(yōu)解，試驗(yàn)的最佳工藝參為糧水比1∶3.49（kg/kg）、大曲添加量59.07%，復(fù)合菌添加量0.40%，發(fā)酵時(shí)間14.06 d，該條件下酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒醪的酒精度理論值為9.01%vol，氨基酸態(tài)氮為0.90 g·100 mL-1。為便于實(shí)際操作，將工藝參數(shù)修正為糧水比1∶3.5（kg/kg）、大曲添加量59%，復(fù)合菌添加量0.40%，發(fā)酵時(shí)間14 d。采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測得酒醪酒精度平均值為8.97%vol，氨基酸態(tài)氮平均值為0.88 g·100 mL-1，與預(yù)測值基本一致，因此采用響應(yīng)面法預(yù)測傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵工藝參數(shù)是可行的。同時(shí)測定最佳工藝參數(shù)條件下不添加復(fù)合菌的酒醪酒精度，為7.13%vol，氨基酸態(tài)氮含量為0.15 g·100 mL-1。計(jì)算可知，優(yōu)化工藝比傳統(tǒng)工藝酒醪酒精度提高了25.81%，氨基酸態(tài)氮含量提高了4.87倍，表明添加復(fù)合菌能有效提高傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵的酒精度和氨基酸態(tài)氮含量，作用顯著。

2.3 添加復(fù)合菌對半成品老陳醋理化指標(biāo)的影響試驗(yàn)

以試驗(yàn)確定的最佳工藝條件及最佳工藝參數(shù)條件下不添加復(fù)合菌為對照，進(jìn)行老陳醋醋酸發(fā)酵試驗(yàn)，檢測半成品老陳醋理化指標(biāo)，結(jié)果見表7。添加復(fù)合菌能顯著提高半成品老陳醋的總酸、氨基酸態(tài)氮和總酯含量，分別較不添加提高了7.14%，126.67%和40.21%。

表7 老陳醋理化指標(biāo)檢測結(jié)果

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到了傳統(tǒng)老陳醋酒精發(fā)酵優(yōu)化工藝：糧水比1∶3.5（kg/kg）、大曲添加量59%，復(fù)合菌添加量0.40%，發(fā)酵時(shí)間14 d。在此條件下，得到的酒醪酒精度為8.97%vol，氨基酸態(tài)氮為0.88 g·100 mL-1，與不添加復(fù)合菌相比，酒精度提高了25.81%，氨基酸態(tài)氮含量提高了4.87倍，所釀造的老陳醋總酸、氨基酸態(tài)氮及總酯含量分別提高了7.14%，126.67%和40.21%。此次試驗(yàn)可為傳統(tǒng)老陳醋生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。