鄧仕彬，林國(guó)榮，林授鍇，潘夢(mèng)柔

莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，枇杷種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（莆田 351100）

蘿卜自古以來(lái)就有“小人參”的佳譽(yù)，是我國(guó)餐桌上的常客，作為一種十字花科植物，在我國(guó)被廣泛種植，品種繁多。紅心蘿卜（Red radish，學(xué)名Raphanus sativusvar. Chinese red meat）是蘿卜品種之一，成本低，來(lái)源豐富，表皮呈紅色或綠色，果肉通紅，肉質(zhì)酥脆爽口，富含花青素，可用于提取營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、安全系數(shù)大的天然蘿卜紅色素，逐漸取代合成色素[1]，被廣泛用于食品[2]、化妝品[3]和醫(yī)藥[4]等領(lǐng)域。但蘿卜紅色素提取過(guò)程中會(huì)破壞蘿卜組織，導(dǎo)致蘿卜中的硫苷被內(nèi)源黑芥子酶水解，形成有異味的小分子含硫化合物，從而使蘿卜紅色素產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激性氣味和臭味[5]。這些異味物質(zhì)包括異硫氰酸酯、硫氰酸酯、二氧化硫、硫化氫等，其中又以異硫氰酸酯為主要成分[6]。蘿卜紅色素異味的存在降低了產(chǎn)品品質(zhì)，嚴(yán)重制約了其在食品中的應(yīng)用與發(fā)展。

目前國(guó)內(nèi)蘿卜紅色素脫味的生產(chǎn)方法主要是利用樹(shù)脂除去硫苷，集中于對(duì)蘿卜紅色素進(jìn)行后期脫味處理[7]。但國(guó)際上對(duì)色素的生產(chǎn)手段有嚴(yán)格限制，利用樹(shù)脂進(jìn)行純化的方法普遍認(rèn)為是不安全的，因此不適宜作為提取無(wú)異味蘿卜紅色素的方法。而其他諸如水蒸氣蒸餾法[8]、酶解法[5]、膜分離法[9]、超臨界CO2萃取[10]等方法，則面臨著生產(chǎn)危險(xiǎn)系數(shù)較高、能耗較大、成本高、膜回收利用困難等問(wèn)題，不適于進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，尋求一種異味脫除效果好，又能用于工業(yè)化生產(chǎn)的高品質(zhì)蘿卜紅色素提取工藝顯得至關(guān)重要。

研究針對(duì)這些問(wèn)題入手，采用多種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法，并在保證蘿卜紅色素提取率的前提下，嘗試多種提取方法的結(jié)合，從而在色素提取過(guò)程中減少或消除蘿卜紅色素中的異味成分，以期達(dá)到較好的除味效果，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的無(wú)異味蘿卜紅色素。通過(guò)比較不同提取方法對(duì)蘿卜色素提取量和除臭程度的影響，確定出最優(yōu)的提取工藝，可為無(wú)異味蘿卜紅色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供思路，并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)蘿卜紅色素的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象

新鮮紅心蘿卜，市售。

1.1.2 主要試劑

檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、醋酸、正己烷、烯丙基異硫氰酸酯、嗎啉、丙酮、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸，以上試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；ST3100型pH計(jì)，奧豪斯儀器有限公司；JYL-CO12型榨汁機(jī)，山東九陽(yáng)股份有限公司；AR124CN型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；SH8-III循環(huán)水式多用真空泵，西安常儀儀器設(shè)備有限公司；J-HH-6A型電熱恒溫水浴鍋，上海盛衛(wèi)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘿卜紅色素提取方法

1.2.1.1 鮮切蘿卜提取蘿卜紅色素

取新鮮紅心蘿卜，洗凈去皮，分割成厚度2～3 nm的蘿卜片，準(zhǔn)確稱取25 g，進(jìn)行榨汁處理，分別收集榨汁液和殘?jiān)?。將殘?jiān)凑?∶5（g/mL）的料液比加入去離子水，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進(jìn)行抽濾，收集浸提液，最后將榨汁液與浸提液混合，定容至250 mL，保存待測(cè)。

1.2.1.2 熱燙處理提取蘿卜紅色素

準(zhǔn)確稱取25 g蘿卜片，立即置于50 mL沸水中熱燙10 min，冷卻后，將蘿卜片進(jìn)行榨汁處理，分別收集熱燙汁液、榨汁液和殘?jiān)?。將殘?jiān)凑?∶5（g/mL）的料液比加入去離子水，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進(jìn)行抽濾，收集浸提液，最后將熱燙汁液、榨汁液與浸提液混合，定容至250 mL，保存待測(cè)。

1.2.1.3 酸性水溶液提取蘿卜紅色素

準(zhǔn)確稱取25 g蘿卜片，進(jìn)行榨汁處理，分別收集榨汁液和殘?jiān)?。將殘?jiān)凑?∶5（g/mL）的料液比加入1%檸檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.5，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進(jìn)行抽濾，收集浸提液，最后將榨汁液與浸提液混合，定容至250 mL，保存待測(cè)。

1.2.1.4 兩相法提取蘿卜紅色素

準(zhǔn)確稱取25 g蘿卜片，進(jìn)行榨汁處理，分別收集榨汁液和殘?jiān)?。將殘?jiān)凑?∶5（g/mL）的料液比加入去離子水，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進(jìn)行抽濾，收集浸提液，最后將榨汁液與浸提液混合，以之前所加入的去離子水1∶1的比例加入正己烷溶液，將混合物在45 ℃下攪拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并靜置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待測(cè)。

1.2.2 酸提法單因素試驗(yàn)對(duì)提取蘿卜紅色素的影響

1.2.2.1 不同提取溫度的影響

提取方法見(jiàn)1.2.1.3，提取溫度分別設(shè)定為15，25，35，45，55和65 ℃。

1.2.2.2 不同提取時(shí)間的影響

提取方法見(jiàn)1.2.1.3，設(shè)定提取時(shí)間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h。

1.2.2.3 不同料液比的影響

提取方法見(jiàn)1.2.1.3，將殘?jiān)謩e以料液比1∶3，1∶5，1∶7，1∶9和1∶11（g/mL）的比例加入1%檸檬酸水溶液。

1.2.2.4 不同提取pH的影響

提取方法見(jiàn)1.2.1.3，浸提pH分別調(diào)至2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和5.5。

1.2.3 提取組合方式對(duì)蘿卜紅色素含量的影響

1.2.3.1 酸性水熱燙法提取蘿卜紅色素

準(zhǔn)確稱取25 g蘿卜片，立即置于50 mL煮沸的1%檸檬酸水溶液中熱燙10 min，冷卻后，將蘿卜片進(jìn)行榨汁處理，分別收集熱燙汁液、榨汁液和殘?jiān)?。將殘?jiān)凑?∶5（g/mL）的料液比加入1%檸檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.5，在45℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進(jìn)行抽濾，收集浸提液，最后將熱燙汁液、榨汁液與浸提液混合，定容至250 mL，保存待測(cè)。

1.2.3.2 酸性水兩相法提取蘿卜紅色素

準(zhǔn)確稱取25 g蘿卜片，進(jìn)行榨汁處理，分別收集榨汁液和殘?jiān)?。將殘?jiān)凑?∶5（g/mL）的料液比加入1%檸檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.5，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進(jìn)行抽濾，收集浸提液，最后將榨汁液與浸提液混合，以之前所加入的1%檸檬酸水溶液1∶1的比例加入正己烷溶液，將混合物在45 ℃下攪拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并靜置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待測(cè)。

1.2.3.3 酸性水熱燙兩相法提取蘿卜紅色素

準(zhǔn)確稱取25 g蘿卜片，立即置于50 mL煮沸的1%檸檬酸水溶液中熱燙10 min，冷卻后，將蘿卜片進(jìn)行榨汁處理，然后分別把熱燙汁液、榨汁液和殘?jiān)M(jìn)行收集。將殘?jiān)凑?∶5（g/mL）的料液比加入1%檸檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.5，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進(jìn)行抽濾，收集浸提液，最后將熱燙汁液、榨汁液與浸提液混合，以之前所加入的1%檸檬酸水溶液1∶1的比例加入正己烷溶液，將混合物在45 ℃下攪拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并靜置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待測(cè)。

1.2.4 蘿卜紅色素的含量測(cè)定

蘿卜紅色素含量測(cè)定方法參考Lee等[11]的pH示差法，使用兩種不同的緩存體系：0.25 mol/L氯化鉀緩沖溶液（pH 1.0）和0.45 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.5）。取1 mL色素提取液放入10 mL的具塞刻度試管中，再加入相應(yīng)的緩存溶液稀釋定容后，分別在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（此次試驗(yàn)通過(guò)光譜掃描確定2種對(duì)應(yīng)體系λman=510和700 nm處吸光度最大），蘿卜紅色素含量可按照式（1）計(jì)算：

式中：A為pH 1.0（A510-A700）-pH 4.5（A512-A700）；MW以天竺葵素-3-葡萄糖苷計(jì)算，相對(duì)分子質(zhì)量為433.2；DF為稀釋倍數(shù)，10；V為提取液最終體積，mL；1 000為單位換算比例，g換算為mg；ε為天竺葵素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)，31 600 cm-1mg-1；m為原料的質(zhì)量，g。

1.2.5 異硫氰酸酯的含量測(cè)定

異硫氰酸酯的含量采用嗎啉滴定法[12]測(cè)定。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

上述的每次試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)測(cè)定。測(cè)定所得數(shù)據(jù)制作成柱形圖以及折線圖進(jìn)行分析，檢驗(yàn)不同提取工藝的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取工藝下蘿卜紅色素含量分析

一些新興的蘿卜紅色素提取方法，如超濾技術(shù)、酶工程技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)、高速分離等，雖具有耗時(shí)少、純度和產(chǎn)量高等特點(diǎn)，但需要的技術(shù)和儀器成本過(guò)高，未能普遍應(yīng)用，因此傳統(tǒng)提取方法仍占據(jù)工業(yè)生產(chǎn)重要地位[13]。常用于提取蘿卜紅色素的溶劑有水、乙醇、甲醇、異丙醇和冰醋酸等，考慮到成本，工業(yè)上一般采用水提法[14]。由圖1可知，熱燙法提取的蘿卜紅色素含量最低，主要是因?yàn)楦邷貤l件下部分蘿卜紅色素分解損失。其次是鮮切法和兩相法，而兩相法僅在鮮切法的基礎(chǔ)上加上了正己烷萃取的步驟，這說(shuō)明正己烷的加入對(duì)蘿卜紅色素的提取量影響較小，這與蘿卜紅色素在正己烷溶劑中溶解度較低相符[15]。但是有研究表明，正己烷對(duì)于蘿卜中硫代葡萄糖苷及其分解產(chǎn)生的一系列小分子含硫化合物均有較好的提取效果[16]。因此，作為食品工業(yè)中提取天然花青素著色劑較為安全且有潛力的有機(jī)溶劑，正己烷在蘿卜紅色素異味去除具有潛在的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[17]。另外，酸提法提取的蘿卜紅色素含量最多，這主要是因?yàn)樗釅A度能夠顯著影響蘿卜紅色素的顏色及穩(wěn)定性，而色素在酸性條件下較穩(wěn)定，在中性或堿性條件下易分解[4]。也有研究表明酸性條件可以加快細(xì)胞壁的破裂，從而增大色素提取率[7]。總體而言，從蘿卜紅色素提取效果而言應(yīng)選提取效率高、省時(shí)、省錢和安全的酸提法。

圖1 不同提取工藝對(duì)蘿卜紅色素提取含量的影響

2.2 酸提法單因素對(duì)提取蘿卜紅色素含量的影響

2.2.1 不同提取溫度下蘿卜紅色素的含量

由圖2可知，酸提法提取的蘿卜紅色素隨著提取溫度的升高，提取量增加，在45 ℃時(shí)提取量為1.48 mg/g，到達(dá)最高值，45 ℃后隨著溫度的升高而逐漸下降。這是因蘿卜紅色素屬于天然花色苷類色素，在酸性條件下提取溫度過(guò)高會(huì)使花色烊陽(yáng)離子降低，且升溫可促進(jìn)傳質(zhì)，有利于提高蘿卜紅色素的提取，但高溫會(huì)導(dǎo)致紅色素的分解，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致提取量的減少[18-19]。因此選擇提取溫度45 ℃最佳。

圖2 提取溫度對(duì)蘿卜紅色素提取量的影響

2.2.2 不同提取時(shí)間蘿卜紅色素的含量

由圖3可以看出，提取時(shí)間在0.5～2 h之間，蘿卜紅色素提取量隨提取時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸增大，但2 h后繼續(xù)增加提取時(shí)間提取量變化不大，結(jié)果表明，在2 h之后增加提取時(shí)間對(duì)蘿卜紅色素的提取量沒(méi)有明顯變化，因而提取時(shí)間2 h最為適合。

2.2.3 不同的提取料液比蘿卜紅色素含量

就單提取率而言，提取料液比越大，越有利于提取色素，但料液配比過(guò)大，提取液中的色素含量太低，將增加生產(chǎn)成本，因此在工業(yè)性生產(chǎn)中需權(quán)衡利弊[20]。由圖4可知，提取料液比在1∶5（g/mL）時(shí)蘿卜紅色素的提取量達(dá)到最大值（1.46 mg/g），在1∶5（g/mL）后隨著料液比增加，蘿卜紅色素的提取量呈緩慢增加趨勢(shì)，這說(shuō)明在殘?jiān)c料液比例為1∶5（g/mL）后再增加料液比對(duì)蘿卜紅色素提取量影響不大，因此，結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本考慮，選擇1∶5（g/mL）提取料液比最佳。

圖3 提取時(shí)間對(duì)蘿卜紅色素提取量的影響

圖4 提取料液比對(duì)蘿卜紅色素提取量的影響

2.2.4 提取pH的確定

在酸性環(huán)境中，花青素基本以紅色的黃鋅鹽形態(tài)存在，而在堿性環(huán)境中，基本以藍(lán)色的醒式形態(tài)存在，當(dāng)處于等電點(diǎn)時(shí)，顏色變到最淺，花青素結(jié)構(gòu)介于黃鋅鹽形式和醒式形式結(jié)構(gòu)之間[21]。從圖5可以看出，蘿卜紅色素的提取量隨著提取的pH增加而逐漸降低，強(qiáng)酸條件可以促進(jìn)植物細(xì)胞壁的分解，且蘿卜紅分子結(jié)構(gòu)在低pH下向醌式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，而醌式結(jié)構(gòu)在水中的溶解度最大，從而使色素的提取率增加[7]。當(dāng)溶液pH為2.5時(shí)，提取的蘿卜紅色素含量達(dá)最大值，因此，選擇提取pH 2.5最佳。

圖5 pH對(duì)蘿卜紅色素提取量的影響

2.3 提取組合方法對(duì)蘿卜紅色素含量的影響

將圖6與圖1對(duì)比分析可以發(fā)現(xiàn)，酸性水熱燙法的提取效果要顯著高于熱燙法，說(shuō)明蘿卜在熱燙基礎(chǔ)上，相對(duì)于去離子水提取，檸檬酸水溶液提取具有較好的提取效果；但是酸性水熱燙法的提取效果略低于酸提法，這說(shuō)明該組合提取方式因蘿卜高溫?zé)釥C導(dǎo)致部分色素分解損失。另外，酸性水兩相法提取效果要高于兩相法則再次說(shuō)明酸性條件色素提取效果較好；酸性水兩相法提取效果與酸提法基本一致，而酸性水兩相法僅在酸提法的基礎(chǔ)上加上了正己烷萃取的步驟，說(shuō)明針對(duì)色素提取效果而言，正己烷的加入對(duì)蘿卜紅色素提取影響不大，這與前述結(jié)果一致。同理，酸性水熱燙兩相法的提取效果要低于酸提法也是因?yàn)楦邷責(zé)釥C色素的損失導(dǎo)致。從圖6可知，3種組合方法中酸性水兩相法的提取效率最高，也是基于另外兩種方法中高溫對(duì)色素的破壞所致。因此，針對(duì)所有提取方法進(jìn)行分析，從蘿卜紅色素的提取效果而言，酸提法和酸性兩相法具有最好的提取效果。

圖6 提取組合方法對(duì)蘿卜紅色素含量的影響

2.4 提取方式對(duì)異硫氰酸酯含量的影響

2.4.1 不同提取工藝對(duì)異硫氰酸酯含量的影響

由圖7可知，鮮切法提取得到的蘿卜紅色素中異硫氰酸酯含量最高，因?yàn)轷r切紅心蘿卜時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞不同部位含有的蘿卜硫苷及黑芥子酶相互接觸，使硫苷分解產(chǎn)生異味成分異硫氰酸酯，因此其含量最高。相對(duì)于鮮切法，酸提法中異硫氰酸酯含量有所降低，低pH下的異硫氰酸酯含量較低可能是由于低pH下黑芥子酶活性受到抑制，蘿卜硫苷水解速率降低，而在pH接近中性的去離子水中，硫苷可以較快進(jìn)行酶降解產(chǎn)生異硫氰酸酯[22]。另外，熱燙法提取得到的蘿卜紅色素中異硫氰酸酯含量最低，說(shuō)明熱燙處理可以滅活黑芥子酶，從而減少蘿卜中硫苷的酶解，降低異硫氰酸酯的生成，達(dá)到大幅度減小色素提取液的臭味的目的。由于常規(guī)高溫處理往往加熱不均勻，導(dǎo)致滅酶活不充分，基于微波在高水分物質(zhì)里具有良好穿透性和快速加熱性的特點(diǎn)，因此也有研究采用高功率微波爐加熱法，使得滅活過(guò)程快速而徹底[7]。從圖7還可以看出，兩相法得到的異硫氰酸酯含量與熱燙法差異較小，說(shuō)明正己烷的加入可以溶解異硫氰酸酯等異味成分，從而降低蘿卜紅色素中的異味，這與Chen等[23]研究結(jié)果一致。蘿卜紅色素本身不溶于正己烷溶劑，因此其在兩相中分配在下相水中，而已經(jīng)酶解產(chǎn)生的異味成分則進(jìn)入上相正己烷中，進(jìn)而將蘿卜紅色素與異硫氰酸酯等異味成分分開(kāi)，達(dá)到除味的效果。

2.4.2 提取組合方式對(duì)異硫氰酸酯含量的影響

熱燙法、酸提法、兩相法相對(duì)于鮮切法均具有較好的除味效果，因此這3種提取方法進(jìn)行綜合研究，旨在保證蘿卜紅色素較好提取率的同時(shí)，降低蘿卜紅色素中的異味成分，以優(yōu)化提取工藝。從圖8可以看出，酸性水熱燙法、酸性水兩相法和酸性水熱燙兩相法相比于單一提取方法，其異硫氰酸酯含量均有不同程度降低，其中酸性水熱燙兩相法含量最低，說(shuō)明3種方法同時(shí)組合對(duì)于異味的去除效果較好。前期的熱燙處理使黑芥子酶失活，甚至為減少蘿卜紅色素?zé)峤到鈸p失而降低熱燙時(shí)間導(dǎo)致酶滅火不足，因?yàn)橄孪鄼幟仕崛芤旱乃嵝?，還能使蘿卜硫苷的酶解過(guò)程受到抑制[24]，而殘留的異硫氰酸酯等異味成分則進(jìn)入到正己烷層中，因此其除異味的效果最好。

圖7 不同提取工藝對(duì)異硫氰酸酯含量的影響

圖8 提取組合方式對(duì)異硫氰酸酯含量的影響

3 結(jié)論

研究表明，蘿卜紅色素提取工藝受提取的溫度、時(shí)間、pH、試劑和料液比等因素的影響，單一提取方法無(wú)法同時(shí)滿足蘿卜紅色素的提取效率及除異味的效果。針對(duì)單一提取方法的不足，通過(guò)提取方法的組合以期達(dá)到較好的效果。就蘿卜紅色素提取效果而言，酸提法和酸性水兩相法具有最佳的提取效果；就除異味效果而言，提取方式的組合相對(duì)于單一提取方法均具有較好的除異味效果，其中酸性水熱燙兩相法得到的色素中異硫氰酸酯含量最低，說(shuō)明其除味效果最好。綜合分析不同提取工藝下蘿卜紅色素的提取效率及除異味效果，酸性水熱燙兩相法雖然因?yàn)闊釥C處理導(dǎo)致蘿卜紅色素含量有所降低，但具有最佳的除味效果，能夠顯著提升蘿卜紅色素的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此擇其為去異味蘿卜紅色素的最佳提取方法。提取條件：選用1%檸檬酸水溶液為提取試劑，熱燙10 min，提取溫度為45 ℃，提取時(shí)間為2 h，提取的料液比為1∶5（g/mL），提取pH為2.5，正己烷于45 ℃兩相攪拌萃取1 h。該方法具有操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，成本低，除味效果好，產(chǎn)量高，安全無(wú)毒，適用于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。