宋健

沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所理化檢驗(yàn)室（沈陽 110136）

啤酒泡沫是啤酒的重要特征指標(biāo)之一，是衡量啤酒特性[1]的一個(gè)重要方面。良好的泡沫性[2-3]不但能提高啤酒清涼爽口的口感，還是優(yōu)良啤酒的一個(gè)顯著評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，啤酒泡沫的性能主要表現(xiàn)在啤酒的起泡性、外觀、泡沫的持久性及泡沫掛杯質(zhì)量[4-5]。純生啤酒由于不經(jīng)過熱殺菌、未受氧化，所以最大限度地保持了啤酒的新鮮度、風(fēng)味物質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。同時(shí)因?yàn)槲唇?jīng)過熱殺菌處理從而殘留一些酶類[3-5]而造成純生啤酒的泡沫持久性降低[6]，這是各企業(yè)及國內(nèi)外研究學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)問題。國內(nèi)外的研究學(xué)者研究認(rèn)為這是由于酒液中存在的蛋白酶A[7-9]及蛋白酶A前驅(qū)物[10]從而破壞泡沫的蛋白造成的。啤酒中含有的來自麥芽等原料的蛋白質(zhì)和多肽[11-13]，它們能夠聚集并起到表面活性劑的作用，同時(shí)增強(qiáng)氣泡的表面黏性和穩(wěn)定性[14-15]。王德良等[16]通過分析啤酒泡沫的作用機(jī)理和生產(chǎn)工藝，研究蛋白酶A對(duì)成品啤酒的泡沫穩(wěn)定性的影響。Hiroto等[17]借助熒光底物法研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中氨基酸含量低時(shí)，酵母能釋放更多的蛋白酶A以保持泡沫穩(wěn)定性。張吉磊等[18]利用BCA法和電泳技術(shù)研究出異-α酸和蛋白含量對(duì)啤酒泡持性的影響。目前對(duì)于純生啤酒的研究主要為其貯存[19]和發(fā)酵[20-21]過程中蛋白酶A和高分子蛋白[22]含量的變化趨勢(shì)，而對(duì)于啤酒泡沫穩(wěn)定性影響條件的相關(guān)機(jī)理的研究較少。

此次試驗(yàn)通過研究純生啤酒不同加工和貯存條件下泡沫保持性的變化規(guī)律和作用機(jī)理，分析影響啤酒泡持值的關(guān)鍵因素，為改善啤酒泡泡沫穩(wěn)定性提供可行性參考和建議。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

雪花純生啤酒（原麥汁濃度為10 °P），華潤(rùn)雪花啤酒（沈陽）有限公司生產(chǎn)；無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白，上海伯奧生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；熒光底物MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys（Dnp）-NH2，日本多肽研究所；蛋白酶K。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

ZMP-P啤酒濁度泡沫測(cè)定儀（成都天平儀器廠））；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；970CRT熒光分光光度計(jì)（上海三科儀器有限公司）；H-2050R型冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；高效液相色譜測(cè)定儀（Waters e2695）。

1.3 啤酒泡持性的測(cè)定

參照GB/T 4928—2008中儀器法（Nibem法）測(cè)定成品啤酒泡持值，平行檢測(cè)3次，取平均值。

1.4 泡沫形成液的提取

純生啤酒待測(cè)樣沿漏斗邊緣勻速倒入1 L的分液漏斗，使泡沫達(dá)850 mL為止，加蓋5 s后打開出樣閥，讓啤酒殘夜放至恰有泡沫流出，并控制在60 s內(nèi)放完，關(guān)閉閥門，得到泡沫生成液。

1.5 蛋白酶A活力檢測(cè)方法

取離心管，加入500 μL pH 5.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，加入440 μL去離子水，再加入40 μL經(jīng)過除氣的待測(cè)純生啤酒樣品，最后加入20 μL 0.2 mmol/L熒光底物。混合均勻后，在避光條件下將離心管蓋緊，放入30 ℃水浴中反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后取出離心管，放入80 ℃水浴中滅活3 min。取出后將樣品迅速冷卻至0 ℃，以10 000 r/min冷凍離心3 min。

處理后的樣品移取750 μL測(cè)定其熒光強(qiáng)度，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及研究，確定儀器條件：激發(fā)波長(zhǎng)λex=328 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=393 nm。空白啤酒樣品需先在80 ℃水浴中保溫10 min滅活蛋白酶A，其他處理過程同檢測(cè)樣品。

由于沒有蛋白酶A標(biāo)準(zhǔn)樣品，查詢相關(guān)文獻(xiàn)可知蛋白酶K與其特征相似，二者作用熒光底物時(shí)破壞兩個(gè)苯丙氨酸鍵基本一致，所以用蛋白酶K來做標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，再檢測(cè)樣品的熒光度，根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算樣品中蛋白酶A活力。

1.6 疏水性多肽分析檢測(cè)

疏水蛋白的提取與純化：將待測(cè)酒樣沿漏斗邊緣勻速倒入1 L的分液漏斗，至泡沫達(dá)到800 mL；10 s后打開放樣閥，讓液體放出至剛好有泡沫流出，立即關(guān)閉放樣閥，低溫處理消泡，得到泡沫生成液。將硫酸銨緩緩加入100 mL泡沫生成液中，使溶液中的硫酸銨飽和度接近80%，靜置1 h后，設(shè)定儀器條件（10 000 r，15 min，20 ℃），離心，棄上清液，取沉淀蛋白待下一步分析。配制25%硫酸銨溶液沉淀蛋白，將溶解后的蛋白通過輸水柱進(jìn)行層析分離。將輸水性凝膠填料Octyl-Sepha-rose CL-4B裝入柱中，用25%飽和硫酸銨清洗并平衡柱子。吸取上清液，用25%硫酸銨洗脫柱子，首先未結(jié)合到柱上的弱疏水性蛋白先被洗脫下來，然后繼續(xù)用去離子水洗脫柱子，中等疏水蛋白被洗脫下來，最后用50%的異丙醇洗脫，則強(qiáng)疏水性蛋白被洗脫下來，分離得到的所有分組都進(jìn)行透析，得到產(chǎn)物并冷凍干燥。疏水性多肽檢測(cè)方法采用高效液相色譜分析法。采用Waters e2695 HPLC儀，Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相為pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩存溶液，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)純生啤酒泡沫性影響

根據(jù)相關(guān)研究[23-24]，啤酒蛋白酶A在20～40 ℃之間活性最強(qiáng)，試驗(yàn)在不同溫度下測(cè)定純生啤酒泡沫穩(wěn)定性以尋求最優(yōu)強(qiáng)化溫度，如圖1所示。溫度對(duì)純生啤酒泡沫的穩(wěn)定性影響顯著，純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性隨著時(shí)間的演唱呈下降趨勢(shì)。當(dāng)貯存溫度為25 ℃時(shí)，啤酒泡沫穩(wěn)定性變化較慢，隨著貯存溫度的增加，啤酒泡沫穩(wěn)定性下降趨勢(shì)明顯，在37 ℃和40 ℃下泡持值降至150 s左右。

圖1 純生啤酒樣品在不同溫度下的泡持變化趨勢(shì)

2.2 純生啤酒在不同溫度下存放過程中蛋白酶A的變化

由圖2可知，當(dāng)貯存溫度為37 ℃和40 ℃時(shí)，蛋白酶A有一定的上升趨勢(shì)，泡持性與蛋白酶A含量存在一定的負(fù)相關(guān)。根據(jù)張彥青等[7]的相關(guān)研究，純生啤酒泡沫衰減主要受蛋白酶A影響，在貯存后期啤酒泡沫穩(wěn)定性的變化主要由蛋白酶A的前驅(qū)物所作用。蛋白酶A在溫度較高環(huán)境下活性有所增強(qiáng)，啤酒泡持性下降明顯。

圖2 純生啤酒樣品在不同溫度下蛋白酶A變化趨勢(shì)

2.3 純生啤酒貯存過程中的泡持性

選取同一批次生產(chǎn)的純生啤酒和經(jīng)殺菌處理的對(duì)照樣品，跟蹤測(cè)定其貯藏過程中的泡沫保持性，結(jié)果如圖3所示。純生啤酒存放過程中，泡沫穩(wěn)定性不斷衰減。其中12 ℃貯存的純生啤酒放1個(gè)月時(shí)泡持性下降約12%，降幅較小；而25 ℃和35 ℃貯存的純生啤酒泡持時(shí)間下降約30%。存放2個(gè)月時(shí)，3種貯存溫度下的純生啤酒泡持時(shí)間分別下降至103，74和62 s。存放3個(gè)月時(shí)啤酒泡沫泡持時(shí)間均降到不足50 s。結(jié)果表明，純生啤酒在較低貯存溫度下，泡沫穩(wěn)定性能維持約1個(gè)月，而溫度較高條件下，存放1個(gè)月時(shí)泡持性下降趨勢(shì)明顯；25 ℃和35 ℃條件下存放2個(gè)月，12 ℃存放3個(gè)月時(shí)，純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性能已經(jīng)變得很差。而同樣溫度下貯存的經(jīng)滅菌處理的純生啤酒對(duì)照樣品，其泡持值雖然隨時(shí)間有所下降，但3個(gè)月后下降程度比純生啤酒要小很多。

圖3 純生啤酒與對(duì)照樣品存放過程中泡持性的變化對(duì)比

2.4 蛋白酶A對(duì)麥汁疏水多肽的關(guān)系研究

試驗(yàn)研究不同麥汁濃度下，即不同蛋白酶A含量下，疏水多肽隨時(shí)間的變化情況，20 ℃反應(yīng)144 h，每24 h取樣1次，利用疏水作用色譜對(duì)麥汁中的多肽進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示。試驗(yàn)表明，隨著時(shí)間的推移，多肽含量呈顯著下降趨勢(shì)，前期變化較快，后期呈緩慢下降。此種變化規(guī)律主要是因?yàn)槠【浦械鞍酌窤的含量呈下降趨勢(shì)，對(duì)疏水多肽的影響減弱；另外一部分疏水多肽對(duì)蛋白酶A產(chǎn)生抗性[11]。

圖4 不同麥汁濃度下疏水多肽含量變化趨勢(shì)

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)主要研究蛋白酶A在不同條件下對(duì)純生啤酒泡沫持久性的影響。蛋白酶A作為影響啤酒泡持性的關(guān)鍵因素，在不同影響因素下展現(xiàn)出差異化的作用效果。在低溫條件下短期內(nèi)貯存啤酒泡持性不會(huì)降低很多，但在25 ℃以上隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，純生啤酒的泡持性會(huì)迅速下降，從而影響啤酒的飲用品質(zhì)。純生啤酒存放過程中蛋白酶A活性、泡持性均出現(xiàn)衰減趨勢(shì)且變化比較明顯。盡管蛋白酶A對(duì)純生啤酒中疏水多肽的水解活性影響較弱，但作用時(shí)間較長(zhǎng)，在一定時(shí)間內(nèi)會(huì)導(dǎo)致純生啤酒泡沫穩(wěn)定性顯著下降，但在一定時(shí)期后蛋白酶A影響作用明顯減弱，這可能是由于部分疏水蛋白對(duì)蛋白酶A產(chǎn)生抗性。蛋白酶A對(duì)純生啤酒泡持性作用受多種因素綜合影響，在純生啤酒制作過程中需要綜合考慮，以達(dá)到啤酒泡持性最佳狀態(tài)。