劉星，秦楠，李銘柔，王小敏，郭麗麗

山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院（晉中 030619）

隨著人們生活壓力的增大及社會節(jié)奏的加快，我國的失眠人群數(shù)量不斷擴大，改善睡眠的產(chǎn)品開發(fā)與研究備受消費者及科研工作者的關(guān)注。酸棗仁是一種常見的藥食兩用中藥，為鼠李科植物酸棗的種子，主要功能為調(diào)節(jié)神經(jīng)、鎮(zhèn)靜催眠、滋養(yǎng)肝臟，在臨床及生活中多用于調(diào)節(jié)失眠[1]。酸棗仁是改善睡眠類產(chǎn)品中較為常見的一種原料，現(xiàn)代研究已表明其所含的皂苷類化合物是其發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的主要有效成分。越來越多的相關(guān)產(chǎn)品趨向于以酸棗仁提取物為原料來開發(fā)功能食品，而不是采用簡單的原藥材打粉的初加工形式。然而，酸棗仁水提物或醇提物顏色較深，大量色素的存在會影響最終產(chǎn)品的感官及后續(xù)的質(zhì)量分析，有必要對酸棗仁提取物進行脫色。

活性炭吸附是常見的、較為成熟的一種脫色方法?；钚蕴勘砻娣e大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、吸附性高，能與溶液中的色素和雜質(zhì)分子充分接觸，從而達到脫色的目的[2]。試驗采用活性炭吸附法對酸棗仁水提物的脫色工藝進行系統(tǒng)優(yōu)化，以期為酸棗仁及其組方方劑在功能食品開發(fā)與研究中的精深應(yīng)用奠定理論與實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設(shè)備

酸棗仁（產(chǎn)地山西，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定，亳州成源中藥飲片有限公司）；川芎、茯苓、甘草、知母（經(jīng)山西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定，河北藥香商貿(mào)專業(yè)中藥材批發(fā)部）；酸棗仁皂苷A標準品（批號181205，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）；粉末活性炭（濟南恒晟環(huán)?？萍加邢薰荆患状?、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均為分析純。

ULTRA-3600紫外-可見分光光度計（北京普源精電科技有限公司）；SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）；KW-1000DC數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；AR223CN分析天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器責任有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酸棗仁水提物的制備[3]

稱取適量酸棗仁，加10倍量水浸泡50 min，煎煮40 min，煎煮2次，合并煎煮液得酸棗仁水提液。

1.2.2 酸棗仁總皂苷含量的測定

以酸棗仁皂苷A為對照品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法測定酸棗仁總皂苷的含量[4]。準確吸取20，50，100，150，200，250和300 μL標準品溶液（0.8 mg/mL）或100 μL樣品溶液于10 mL具塞試管中，加熱揮盡溶劑，分別加入1 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和4 mL高氯酸，混勻后于65 ℃水浴中加熱20 min，冰浴冷卻至室溫，在490 nm處測吸光度，由回歸方程求得酸棗仁總皂苷的含量。

1.2.3 脫色工藝的單因素試驗

取若干小錐形瓶，分別向其中加入20 mL酸棗仁水提液，在一定的活性炭用量（0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%）、脫色溫度（20，30，40，50和60℃）、脫色時間（5，10，15，20和25 min）和攪拌速度（90，120，150，180，210和240 r/min）下對酸棗仁水提液進行脫色，抽濾得濾液后分別測定皂苷保留率和脫色率，并計算綜合評分，其中各因素固定水平為活性炭用量0.8%、脫色溫度20 ℃、脫色時間15 min、攪拌速度120 r/min。

脫色工藝中所用的活性炭預(yù)處理方法[5]：將活性炭用5%鹽酸溶液浸泡過夜，沸煮30 min，用去離子水洗至中性，于120 ℃烘干備用。

1.2.4 脫色工藝的響應(yīng)面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，進一步研究活性炭用量（A）、脫色溫度（B）和脫色時間（C）3個因素之間的交互作用，以由脫色率和皂苷保留率組成的綜合評分為指標，采用Design-Expert軟件，應(yīng)用Box-Behnken原理進行三因素三水平試驗（共17組），從而確定最優(yōu)的脫色工藝。響應(yīng)面因素水平編碼表如表1所示。

綜合評分采用加權(quán)法，總分100分，將脫色率和皂苷保留率兩者的權(quán)重值均設(shè)為50，按照式（1）計算綜合評分。

1.2.5 脫色效果指標的測定

通過測定脫色率和皂苷保留率綜合評價脫色效果。脫色率的測定方法：取20 mL酸棗仁水提液加入適量活性炭進行脫色，抽濾分離活性炭后得脫色后濾液，在410 nm處分別測定脫色前后水提液的吸光度，按式（2）計算脫色率[6]：

皂苷保留率的測定方法：取20 mL酸棗仁水提液加入適量活性炭進行脫色，抽濾分離活性炭后得脫色后濾液，將該濾液置于水浴鍋中濃縮10倍后作為脫色后樣品溶液。同理，從等量酸棗仁水提液中制得脫色前樣品溶液，然后按1.2.2小節(jié)測定脫色前后水提液中的總皂苷含量，并按式（3）計算皂苷保留率[6]。

1.2.6 脫色工藝的初步應(yīng)用

鑒于采用組方方劑是開發(fā)功能保健食品的一種有效途徑，該部分將優(yōu)化出的脫色工藝用于重用酸棗仁的方劑酸棗仁湯[7]中（組方包含酸棗仁15 g、川芎6 g、茯苓6 g、知母6 g、甘草3 g，用于去心火、治失眠），通過比較脫色前后提取液的色澤，評價脫色工藝的實際應(yīng)用效果。按規(guī)定用量將酸棗仁湯各味藥材浸泡50 min后煎煮40 min，煎煮2次，將煎煮液進行抽濾，得一定體積脫色前水煎液。然后按前述脫色工藝將22.5 g單味中藥酸棗仁水提物脫色，將此脫色液與其余中藥煎煮液（甘草、知母、茯苓、川芎）混合制成等體積脫色后水煎液。將上述脫色前及脫色后水煎液分別在410 nm處測定吸光度，采用1.2.5小節(jié)公式計算得出脫色率，從而評價脫色工藝的應(yīng)用效果。

需要說明的是，為保證活性成分的含量不變，此處以脫色前后酸棗仁皂苷的含量相等為依據(jù)，按脫色后66.70%的皂苷保留率計。經(jīng)計算可知，脫色后的22.5 g酸棗仁用量相當于原方中的15 g酸棗仁用量，因此脫色前后方劑中酸棗仁原料用量有所不同。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖，結(jié)果以3次平行的“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁皂苷的標準曲線

按照1.2.2所述，酸棗仁皂苷A的線性回歸方程為y=0.024 3x+0.034 2（R2=0.993 3），結(jié)果表明酸棗仁皂苷A在質(zhì)量濃度范圍3.20～48.00 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 脫色工藝的單因素試驗

2.2.1 活性炭用量對脫色工藝的影響

如圖1所示，活性炭用量在0.2%～1.0%范圍內(nèi)，脫色率與活性炭用量呈明顯的正比關(guān)系，同時皂苷保留率與活性炭用量呈反比。這是由于活性炭用量的增加會增大吸附比表面積，相應(yīng)的吸附量也逐漸升高[8]，使得溶液中的色素分子及皂苷類物質(zhì)越來越多地被吸附，從而出現(xiàn)脫色率不斷上升、皂苷保留率不斷下降的現(xiàn)象。

圖1 活性炭用量對酸棗仁水提物脫色率與皂苷保留率的影響

圖2為活性炭用量對脫色效果的影響，隨著活性炭用量的增加，脫色效果綜合評分總體呈先上升后下降的趨勢，其中0.8%活性炭用量下的綜合評分最高。綜合考慮脫色效果與皂苷保留情況，選取活性炭用量0.6%，0.8%和1.0%作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

圖2 活性炭用量對酸棗仁水提物脫色效果綜合評分的影響

2.2.2 脫色溫度對脫色工藝的影響

如圖3所示，脫色率隨脫色溫度的提高呈先上升后基本不變的趨勢，這是由于溫度升高，體系的黏度減小，增強了分子的擴散運動從而加強了色素顆粒與活性炭之間的吸附傳質(zhì)，使脫色率不斷上升[9]。當著色物質(zhì)與活性炭的吸附達到平衡時，脫色率不再升高。皂苷保留率隨脫色溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，這可能是由于20 ℃的較低溫度比較有利于酸棗仁皂苷分子的吸附，使得皂苷保留率較小；隨著溫度的升高，分子運動增強，其他分子不斷被競爭吸附的同時促進了酸棗仁皂苷的解吸，因此30 ℃時皂苷保留率升高且達到最大；此時溶液中皂苷濃度的增大又會促進正吸附，使得溫度繼續(xù)升高時酸棗仁皂苷保留率發(fā)生下降。

如圖4所示，隨著脫色溫度的提高，脫色效果綜合評分呈先上升后下降的趨勢，且脫色溫度為30 ℃時綜合評分最高，說明脫色溫度確實不宜過高，否則在影響脫色效果的同時還可能引起皂苷類活性物質(zhì)的變化。綜合考慮，選取脫色溫度20，30和40 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

圖3 脫色溫度對酸棗仁水提物脫色率與皂苷保留率的影響

圖4 脫色溫度對酸棗仁水提物脫色效果綜合評分的影響

2.2.3 脫色時間對脫色工藝的影響

如圖5所示，隨著脫色時間的延長，脫色率總體呈上升趨勢，而皂苷保留率呈下降趨勢。這可能是由于活性炭脫色是一個動態(tài)的吸附與解吸過程，而吸附平衡的達到需要一定的時間[10]，在試驗所用的25 min脫色時間范圍內(nèi)，尚未到達完全吸附平衡，而是處于吸附大于解吸的過程，因而脫色率不斷升高、皂苷保留率不斷下降。

圖5 脫色時間對酸棗仁水提物脫色率與皂苷保留率的影響

如圖6所示，以脫色時間20 min的綜合評分較其他時間略高，因此將脫色時間15，20和25 min作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

圖6 脫色時間對酸棗仁水提物脫色效果綜合評分的影響

2.2.4 攪拌速度對脫色工藝的影響

如圖7所示，隨著攪拌速度的逐漸加快，脫色率逐漸增加，當攪拌速度達到150 r/min時，脫色率大幅提高，之后繼續(xù)增加攪拌速度，脫色率也基本保持不變；皂苷保留率的變化與脫色率正好相反，呈先逐漸下降后基本不變的趨勢。這可能是由于攪拌速度的增加可以促進分子的擴散運動，從而加快活性炭的吸附作用[11]，使得脫色率不斷上升、皂苷保留率不斷下降；但是當吸附接近平衡時，即使繼續(xù)增大攪拌速度，脫色率和皂苷保留率也無明顯變化。

圖7 攪拌速度對酸棗仁水提物脫色率與皂苷保留率的影響

如圖8所示，不同攪拌速度對綜合評分的影響不是很大，基本都在87分左右，因此在響應(yīng)面優(yōu)化時將攪拌速度固定為150 r/min，不再作進一步考察。

圖8 攪拌速度對酸棗仁水提物脫色效果綜合評分的影響

2.3 脫色工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗的結(jié)果及方差分析

表2為17組試驗的結(jié)果。對試驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得回歸模型方程：綜合評分Y=93.47-2.57A+2.24B+1.97C-3.33AB-0.60AC-1.00BC-6.23A2-2.59B2-5.48C2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

由表3的回歸模型方差分析可知，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2以及交互項AB對脫色效果有極顯著的影響（p＜0.01）。F值反映出各因素對響應(yīng)值影響強弱的順序：A＞B＞C。方程的模型極顯著（p＜0.000 1），失擬項不顯著（p＞0.05），模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.975 5，說明模型可解釋97.55%的響應(yīng)值變化，表明模型成立。變異系數(shù)為1.04%，信噪比為22.630＞4，表明試驗本身精確度高，結(jié)果可靠性大，回歸方程擬合度良好。

表3 Box-Behnken試驗方差分析

通過響應(yīng)面圖可更直觀分析各因素對響應(yīng)值的影響以及各因素間的交互效應(yīng)。響應(yīng)面的坡度反映各因素變化對響應(yīng)值的影響，坡度越陡峭，則響應(yīng)值對該因素的變化越敏感；坡度越平緩，說明該因素對響應(yīng)值的影響越小。等高線的形狀及疏密程度則反映了兩因素交互效應(yīng)的強弱，等高線呈橢圓形且曲線密集體現(xiàn)其互作效應(yīng)對響應(yīng)值的影響顯著，若為圓形且曲線稀疏則影響不顯著[12]。如圖9所示，活性炭用量與脫色溫度的等高線（圖9a）呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著；圖9（b）和圖9（c）的等高線呈圓形，說明活性炭用量與脫色時間兩因素、脫色溫度與脫色時間兩因素之間的交互作用不明顯，結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。根據(jù)二次多元回歸方程的擬合，得到最佳脫色工藝的預(yù)測值：攪拌速度150 r/min、活性炭用量0.72%、脫色溫度36.58 ℃、脫色時間20.71 min。此時最佳綜合評分為94.84分。

2.3.2 最佳工藝條件的驗證

根據(jù)最佳工藝預(yù)測值將試驗條件確定為活性炭用量0.70%，脫色溫度36.50 ℃、脫色時間20.7 min，攪拌速度150 r/min。重復3次，計算平均值，此時脫色率為91.08%，皂苷保留率為66.70%，綜合評分為94.21分，接近預(yù)測值，說明得到的最佳工藝條件可靠。

圖9 脫色工藝優(yōu)化的響應(yīng)面圖

2.4 脫色工藝的初步應(yīng)用

以經(jīng)典的酸棗仁湯為例，利用上述優(yōu)化后的脫色工藝將當量的單味酸棗仁水煎液進行脫色后，再將脫色液與其他藥材煎煮液混合，得到如圖10（b）所示的煎煮液。與圖10（a）的傳統(tǒng)煎煮液相比，采用脫色工藝后的水煎液顏色明顯減淡，綜合脫色率為63.73%，脫色效果顯著。此時酸棗仁總皂苷含量相當，約為20 μg/mL，說明該脫色工藝可在保證產(chǎn)品功效成分基本不受影響的前提下，擺脫傳統(tǒng)中藥水煎提取液在應(yīng)用于新型食品研究與開發(fā)過程中顏色過深的問題，從而促進以酸棗仁為主藥的經(jīng)方與名方在功能食品開發(fā)中的應(yīng)用，在延伸中藥材產(chǎn)業(yè)鏈的同時促進食品工業(yè)的發(fā)展。

圖10 酸棗仁湯脫色前后效果比較

3 結(jié)論

活性炭吸附可用于酸棗仁水提物的脫色，以由脫色率和皂苷保留率所組成的脫色效果綜合評分為指標，通過單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法得到酸棗仁水提物的最佳脫色工藝：活性炭用量0.7%，脫色溫度36.5℃，脫色時間20.7 min，攪拌速度150 r/min。最佳工藝下脫色率為91.08%，皂苷保留率為66.70%，綜合評分為94.21分。所得脫色工藝在酸棗仁湯的脫色應(yīng)用中效果顯著，組方水提液顏色明顯減淡，為酸棗仁及其組方方劑在功能食品中的精深開發(fā)和有效應(yīng)用提供了科學依據(jù)與實踐基礎(chǔ)。