尹玉林， 馬文馨， 李亞娟， 田新會(huì), 杜文華

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

貓尾草(Phleumpratense)又稱梯牧草[1]，原產(chǎn)于歐亞大陸，遍及溫帶及靠近北極約北緯 40°～50°的寒冷濕潤(rùn)地區(qū)[2]，主要有‘鬼蠟燭’(P．paniculatum)、‘高山’貓尾草(PhleumpratenseL. ‘Gaoshan’)、‘假梯牧草’ (P．phleoides) 3個(gè)野生種。貓尾草草質(zhì)鮮嫩、品質(zhì)優(yōu)良、消化性能好，可調(diào)制青干草、草粉和青貯飼料，為草食家畜所喜食的長(zhǎng)纖維禾本科牧草[2-3]。貓尾草的粗蛋白和水溶性碳水化合物含量較低[4]，但對(duì)家畜身體有不可小覷的積極作用，是賽馬和奶牛的優(yōu)質(zhì)飼草，飼喂奶?？裳娱L(zhǎng)產(chǎn)奶期[5]，是維持和創(chuàng)造高產(chǎn)水平奶牛不可缺少的重要飼草之一[6]。近年來，隨著現(xiàn)代生活方式和人們生活觀念的轉(zhuǎn)變，賽馬和寵物的數(shù)量越來越多，貓尾草作為賽馬和寵物的優(yōu)質(zhì)牧草，需求量越來越大。但由于貓尾草品種更新復(fù)壯緩慢，目前國(guó)內(nèi)審定登記的品種有‘岷山’貓尾草(PhleumpratenseL. ‘Minshan’)和‘川西’貓尾草(PhleumpratenseL. ‘Chuanxi’)及‘克力瑪’貓尾草(PhleumpratenseL. ‘Climax’)[7]。適合于甘肅高寒陰濕區(qū)種植的‘岷山’貓尾草由于種植時(shí)間較長(zhǎng)，品種退化嚴(yán)重，對(duì)貓尾草產(chǎn)業(yè)發(fā)展極為不利[8]。培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的貓尾草新品種是甘肅省貓尾草產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。

甘肅省高寒陰濕區(qū)冬季溫度較低，抗寒性強(qiáng)弱也是衡量新品系優(yōu)劣的重要指標(biāo)。植物的抗寒性是受環(huán)境條件自然選擇進(jìn)化的結(jié)果，由其本身的遺傳特性決定[9]。正常情況下，植物的葉片舒展，莖稈直立，葉片呈綠色。當(dāng)受到低溫脅迫時(shí)，植物細(xì)胞失水變得皺縮，導(dǎo)致植物葉片和莖稈萎縮，葉片翻卷、脫落[10-11]。當(dāng)溫度在0℃以下時(shí)，細(xì)胞膜脂過氧化，葉片含水量增加，細(xì)胞間或胞內(nèi)結(jié)冰，細(xì)胞失去膨壓后組織變得柔軟，隨后葉色變褐，最終死亡[12]。在低溫條件下，植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生各種生理生化反應(yīng)：首先是低溫導(dǎo)致植物細(xì)胞有害物質(zhì)的積累，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定程度后植物體內(nèi)保護(hù)機(jī)制起調(diào)節(jié)作用，避免植物受到傷害[13-14]。

為此，本項(xiàng)目組以前期研究[15-17]篩選出的貓尾草品種(Commonl，‘岷山’貓尾草，Goliatl)為親本，結(jié)合貓尾草異花授粉和小穗太小很難進(jìn)行有性雜交的實(shí)際，利用綜合品種選育法培育出貓尾草新品系，并對(duì)其草產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)[15-16]。本試驗(yàn)擬以‘岷山’貓尾草和‘川西’貓尾草為對(duì)照，以評(píng)價(jià)新品系抗寒性強(qiáng)弱，為貓尾草品種選育工作提供參考，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，抗性強(qiáng)的貓尾草新品種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料是甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)以‘岷山’貓尾草、由加拿大引入的‘Goliatl’和‘Commonl’品種為親本，利用綜合品種培育法培育的貓尾草新品系，對(duì)照為‘川西’貓尾草和‘岷山’貓尾草品種。

1.2 幼苗培養(yǎng)及處理

本試驗(yàn)采用花盆種植，將3份貓尾草材料種植于花盆內(nèi)，4次重復(fù)，每盆定植2株。花盆直徑為20 cm、深15 cm，混合栽培基質(zhì)為農(nóng)田土∶羊糞=9∶1(質(zhì)量比)，花盆內(nèi)裝等量混合栽培基質(zhì)。置于室溫下，并定期澆水，以保證幼苗的正常生長(zhǎng)。待出苗后50 d，將試驗(yàn)材料置于人工培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫脅迫處理，每個(gè)材料重復(fù)4次。試驗(yàn)采用二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，A因素為貓尾草材料，設(shè)3個(gè)水平(A1：貓尾草新品系T，A2：‘川西’貓尾草品種CK1，A3：‘岷山’貓尾草CK2)；B因素為低溫處理，設(shè)4個(gè)水平(B1：0℃，B2：—10℃，B3：—20℃，B4：—30℃)，進(jìn)行低溫處理時(shí)，首先將供試材料在0℃培養(yǎng)箱中冷適應(yīng)24 h(光培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h)，然后分別置于—10℃，—20℃和—30℃處理8 h[18]，后于0℃培養(yǎng)箱中緩苗2 h。低溫處理結(jié)束后，立刻剪取葉片，將其混勻，稱重，錫紙包裹，并用液氮迅速冷凍，置于—80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖(Soluble sugar,SS)含量；葉綠素含量采用丙酮提取法測(cè)定；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量；采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性；采用紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性[19]。以上指標(biāo)測(cè)定均設(shè)3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，在SPSS19.0中用二因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對(duì)不同處理的相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，F(xiàn)檢驗(yàn)顯著時(shí)用Duncans法進(jìn)行多重比較。

1.5 綜合評(píng)價(jià)

抗寒性綜合評(píng)價(jià)應(yīng)用隸屬函數(shù)法[20]。生理指標(biāo)與抗寒性正相關(guān)時(shí)，用公式：

負(fù)相關(guān)公式：

式中：i表示某一貓尾草材料，j表示測(cè)定指標(biāo)，Xij表示某一貓尾草材料第j指標(biāo)的測(cè)定值，Xjmax表示所有貓尾草材料j指標(biāo)的最大值，Xjmin表示所有貓尾草材料j指標(biāo)的最小值，Uij表示某一貓尾草材料j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，供試貓尾草材料間的各個(gè)指標(biāo)均無顯著差異；低溫處理顯著影響SS含量及POD和CAT酶的活性(P<0.01)；貓尾草材料×低溫脅迫交互作用顯著影響所測(cè)所有指標(biāo)(P<0.01)。

表1 貓尾草材料間、低溫脅迫間和貓尾草材料×低溫脅迫交互作用間抗寒性相關(guān)生理生化指標(biāo)的方差分析Table 1 Analysis of variance of physiological and biochemical indexes related to cold resistance between Timothy materials,low temperature stress and Timothy materials×Low temperature stress interaction

2.1 低溫脅迫對(duì)貓尾草生理生化指標(biāo)的影響

由表2可知，在0℃低溫處理時(shí)，3份貓尾草的平均SS含量(21.44 mg·g-1)極顯著高于其他低溫處理(P<0.01)；隨著脅迫程度的加劇，供試材料的SS含量先下降后上升，并在—20℃時(shí)SS含量最低(8.60 mg·g-1)，—30℃時(shí)SS含量達(dá)到13.64 mg·g-1。隨著低溫脅迫加劇，3個(gè)供試貓尾草材料的平均POD活性先增高后降低。0℃時(shí)最低(248.17 U·g-1·min-1)，—20℃時(shí)POD活性(606.23 U·g-1·min-1)最高并顯著高于其他處理(P<0.05)，—30℃時(shí)POD活性有所下降，但與—10℃和0℃無顯著差異。3個(gè)供材料的平均CAT活性隨著低溫脅迫加劇不斷升高，—30℃時(shí)最高(631.51 U·g-1·min-1)，顯著高于除-20℃外的其他處理(P<0.05)?！?0℃和—10℃的平均CAT活性無顯著差異，0℃時(shí)CAT活性顯著低于—20℃和—30℃的處理(P<0.05)。

表2 低溫脅迫對(duì)貓尾草生理生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of low temperature stress on physiological and biochemical indexes of timothy grass

2.2 貓尾草材料×低溫脅迫處理交互作用間抗寒性相關(guān)生理生化指標(biāo)的差異

0℃時(shí)貓尾草新品系(T)的SS含量(20.57 mg·g-1)最低，且顯著低于兩對(duì)照(P<0.05)。在其余3個(gè)低溫處理中T的SS含量均顯著高于CK1和CK2(P<0.05)(圖1(a))。圖1(b)表明，0℃和-30℃時(shí)新品系(T)的MDA含量均顯著高于CK1(P<0.05)，而—10℃和—20℃時(shí)，則顯著低于兩對(duì)照(P<0.05)。隨著低溫脅迫加劇，新品系(T)的葉綠素含量逐漸升高，0℃和—10℃時(shí)與兩對(duì)照無顯著差異，—20℃時(shí)與CK2無顯著差異，但顯著低于CK1(P<0.05)，—30℃時(shí)顯著高于CK1和CK2(P<0.05)(圖1(c))。圖1(d)表明，在各個(gè)低溫脅迫處理下，貓尾草新品系(T)的SOD活性均為最大值，且顯著高于兩對(duì)照(P<0.05)。由圖1(e)可知，0℃時(shí)新品系(T)的POD活性與CK1和CK2無顯著性差異，在—10℃，—20℃和—30℃時(shí)其POD活性顯著高于CK1和CK2(P<0.05)?！?0℃和—20℃時(shí)新品系(T)的CAT活性均顯著高于CK1而顯著低于CK2，—30℃時(shí)新品系T的CAT活性最高(768.73 U·g-1·min-1)且顯著高于兩對(duì)照(P<0.05)(圖1(f))。

圖1 貓尾草材料×低溫脅迫處理交互作用間抗寒性相關(guān)生理生化指標(biāo)的差異Fig.1 Differences in physiological and biochemical indexes related to cold resistance between timothy grass materials and low temperature stress

2.3 不同貓尾草材料抗寒性綜合評(píng)價(jià)

由上述結(jié)果看出，3個(gè)貓尾草材料中新品系(T)的抗寒性較強(qiáng)，為進(jìn)一步確定其材料間抗寒性差異，本試驗(yàn)用隸屬函數(shù)法將測(cè)定的幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，隸屬函數(shù)值見表3，抗寒性排序見表4。綜合評(píng)價(jià)表明，3個(gè)貓尾草材料中，新品系(T)的抗寒性強(qiáng)于CK1和CK2。

表3 不同貓尾草材料抗寒性的隸屬函數(shù)值Table 3 Membership function values of cold resistance of different timothy grass materials

表4 貓尾草材料的隸屬函數(shù)平均值及抗寒性排序Table 4 Mean function and ranking of cold resistance of Timothy materials

3 討論

植物的抗寒性是指植物長(zhǎng)期處于低溫寒冷環(huán)境的過程中，通過自身的遺傳變異和自然選擇獲得的一種抗寒能力[21-25]，不同植物抗寒性不同，甚至同一植物不同器官的抗寒性也不一樣[26-29]。植物通過滲透調(diào)節(jié)、光合反應(yīng)和酶保護(hù)系統(tǒng)等方式應(yīng)對(duì)逆境條件下受到的傷害。研究表明，與植物抗寒性相關(guān)的因素主要有SS、葉綠素、MDA量及SOD，POD和CAT等酶的活性[30]。SS、葉綠素含量和植物的抗寒能力呈正相關(guān)，因此植物材料SS和葉綠素含量越高其抗性越強(qiáng)，MDA則相反，MDA是植物膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，對(duì)細(xì)胞膜有毒害作用，低溫脅迫程度越大，植物累積的MDA越多[33]?；钚匝醯姆e累導(dǎo)致膜質(zhì)間的空隙增大，細(xì)胞通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)質(zhì)和氧離子外泄，膜質(zhì)系統(tǒng)遭到破壞后，植物正常所需的營(yíng)養(yǎng)得不到提供，生命活動(dòng)受阻[31]。張宗花[32]通過研究4種禾草在不同低溫脅迫下的生理生化響應(yīng)得出，垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb)和青海冷地早熟禾(PoacrymophilaKeng)在遇到低溫脅迫后，MDA含量大幅度的升高，說明兩者受傷害的程度較大。

本研究結(jié)果表明，3份參試貓尾草材料中，貓尾草新品系(T)的MDA含量位于兩對(duì)照之間，而CK2最高，CK1最低，說明在低溫處理下CK2受脅迫影響程度最大，抗寒性較差。而新品系T的SS含量和葉綠素含量及葉片SOD，POD，CAT活性均高于兩對(duì)照，說明新品系(T)的抗寒性較好。綜合以上結(jié)果可知，僅用單一指標(biāo)是不能衡量材料的抗寒性強(qiáng)弱，需要進(jìn)一步研究分析。

3.1 低溫脅迫間貓尾草生理生化指標(biāo)的差異及原因

SS是細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)中的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，水解酶活性被激發(fā)，水解植物體內(nèi)的淀粉為SS，從而增加了細(xì)胞液濃度，因此植物的抗寒能力增強(qiáng)[13]。本研究表明，0℃時(shí)供試貓尾草材料SS含量最高，這是因?yàn)樨埼膊莶牧鲜艿降蜏孛{迫后，導(dǎo)致生理代謝紊亂，使SS含量下降，當(dāng)?shù)蜏孛{迫到達(dá)一定程度后，植物增加SS含量以調(diào)節(jié)植物機(jī)理[33]。隨著低溫脅迫加劇，SS含量先下降后升高，這與楊丹等[34]研究結(jié)果有差異，可能是因?yàn)椴煌奈锓N，其遺傳特性各異，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)方式不同，導(dǎo)致其抗寒機(jī)制存在差異。3份參試材料中，貓尾草新品系(T)的平均SS含量最高，說明其抗寒性較強(qiáng)。

植物體內(nèi)的酶保護(hù)系統(tǒng)對(duì)植物有積極防御作用。在遇到低溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的SOD，POD和CAT共同協(xié)調(diào)以清除體內(nèi)產(chǎn)生的過多活性氧自由基，防止膜脂過氧化，減輕自由基對(duì)植物細(xì)胞造成的傷害，從而保護(hù)植物[31]。本試驗(yàn)也得出相似結(jié)果：隨著低溫脅迫加劇，3種材料之間貓尾草材料的SOD，POD和CAT活性增強(qiáng)，CAT活性在—30℃時(shí)最大，SOD和POD活性在—20℃時(shí)達(dá)到最大，在—30℃時(shí)有所降低。當(dāng)貓尾草受到低溫脅迫時(shí)，本身會(huì)對(duì)脅迫產(chǎn)生一定響應(yīng)，通過增加體內(nèi)的SOD，POD和CAT酶以抵抗外界環(huán)境的脅迫。3個(gè)貓尾草材料間，新品系的SOD，POD，CAT活性均高于其余兩個(gè)對(duì)照，因此可以看出新品系(T)抗寒性較強(qiáng)，這與綜合評(píng)價(jià)結(jié)果一致(表3)。

3.2 貓尾草材料×低溫脅迫處理交互作用間抗寒性相關(guān)生理生化指標(biāo)的差異及原因

MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，對(duì)植物有毒害作用，但MDA間接反映植物受到外界脅迫的傷害程度。隨著低溫脅迫加劇，植物體內(nèi)的MDA含量不斷上升[35]。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著低溫脅迫加劇，3份供試貓尾草材料的MDA含量不斷升高，說明3個(gè)貓尾草材料遇到低溫時(shí)都受到了一定程度損傷。但3份貓尾草材料中，T和CK1的平均MDA含量較低，說明在低溫脅迫下T和CK1的抗寒性較強(qiáng)。

3份參試材料中，新品系(T)的葉綠素含量高于兩對(duì)照，抗寒性較強(qiáng)。葉綠素含量隨低溫脅迫加劇持續(xù)升高，—30℃時(shí)顯著(P<0.05)高于CK1和CK2，而可溶性糖含量在0℃時(shí)最小，隨著低溫脅迫加劇，T的可溶性糖含量顯著高于CK1和CK2(P<0.05)。新品系(T)POD活性顯著(P<0.05)高于其他兩對(duì)照，也進(jìn)一步說明新品系(T)的抗寒性較強(qiáng)。

不同的貓尾草對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)不同，為了客觀評(píng)價(jià)3份參試貓尾草的抗寒性，使用隸屬函數(shù)來分析(表4)。由多個(gè)指標(biāo)綜合表明3種參試材料抗寒性：T >CK2 >CK1。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)供試材料的生理生化特性研究發(fā)現(xiàn)新品系(T)的抗寒性強(qiáng)于兩對(duì)照(‘岷山’貓尾草和‘川西’貓尾草)，為貓尾草品種選育工作提供參考，為培育抗性強(qiáng)的貓尾草新品種奠定基礎(chǔ)。