陳立強(qiáng)，白小明

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730722；2. 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)

細(xì)齒草木樨(MelilotusdentatusPers.)為豆科草木樨屬一年生草本植物，產(chǎn)量高、品質(zhì)好，具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄、抗風(fēng)沙等特性，是優(yōu)良的牧草、綠肥和水土保持植物。細(xì)齒草木樨香豆素含量是黃花草木樨(MelilotusofficinalisPall.)的1/28～1/122，是白花草木樨(MelilotusalbusDesr.)的1/35～1/140，由于其香豆素含量較低而被譽(yù)為“無味草木樨”。細(xì)齒草木樨適口性較好，具有較高的飼用價(jià)值，在我國主要分布在東北的西部、內(nèi)蒙古的中東部和黃河流域的寧夏、陜西、山西、河南和河北上東等地[1-3]。

種子發(fā)芽力是指種子成為正常種苗的能力，決定著種子能否用作播種材料，受內(nèi)部因素和外部環(huán)境的雙重影響，其中胚發(fā)育不完全和生理未成熟，種皮的硬實(shí)和胚乳的阻礙等內(nèi)部因素都會遏制種子萌發(fā)[4-5]。為了解決這一難題，大量研究從種子結(jié)構(gòu)方面對萌發(fā)限制因素進(jìn)行了探索。祝明珠等[6]研究了多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)種子結(jié)構(gòu)和發(fā)芽率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)柵欄細(xì)胞層、胚乳細(xì)胞和脂類物質(zhì)可能都是種子萌發(fā)的限制因素；宋蕓等[7]研究表明苦參(SophoraflavescensAlt.)種子的角質(zhì)層和骨狀石細(xì)胞層可能與種子休眠有關(guān)；桂喆和孫海群[8]對白花草木樨、黃花草木樨和其它4種豆科植物種子結(jié)構(gòu)和硬實(shí)的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)柵欄細(xì)胞層和骨狀石細(xì)胞層可能是影響豆科植物種子硬實(shí)的主要因素。從種子結(jié)構(gòu)判斷，不同物種影響其種子萌發(fā)的因素也各不相同。目前關(guān)于草木樨屬種子結(jié)構(gòu)的研究以黃花草木樨和白花草木樨為主[8]，缺乏對細(xì)齒草木樨的研究，且相關(guān)研究報(bào)道只局限于某一階段種子的結(jié)構(gòu)分析[8]，缺乏成熟過程中種子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究。

由于不同成熟階段種子的產(chǎn)量和質(zhì)量都不盡相同[9-11]，不恰當(dāng)?shù)氖斋@時(shí)間會導(dǎo)致種子產(chǎn)量減少和品質(zhì)下降。收獲時(shí)間過早，種子的生活力較弱、產(chǎn)量較低、質(zhì)量較差；收獲時(shí)間過晚，落粒性增強(qiáng)[12]。前人研究表明，白花草木樨種子適宜的收獲時(shí)間是盛花后33～42 d[9]，但由于同屬不同種或品種的花期存在差異[13-14]，尚不清楚其它草木樨的種子收獲時(shí)間是否與白花草木樨相吻合。目前我國草木樨種子嚴(yán)重缺乏，明確細(xì)齒草木樨及同屬其它牧草種子適宜的收獲時(shí)間，有助于提高種子的產(chǎn)量和品質(zhì)，對其推廣種植具有重要的意義。

為了使試驗(yàn)結(jié)果可靠實(shí)用，貼近生產(chǎn)，本研究以生產(chǎn)性能優(yōu)異的細(xì)齒草木樨為材料，參考普通高等教育“十一五”國家級規(guī)劃教材《牧草種子學(xué)》[15]定義的4個(gè)種子成熟階段，依據(jù)大田種子的形態(tài)特征進(jìn)行取樣，通過分析成熟過程中種子細(xì)胞結(jié)構(gòu)、產(chǎn)量和質(zhì)量的變化規(guī)律，探索影響細(xì)齒草木樨種子發(fā)芽力的主要因素，為促進(jìn)種子萌發(fā)，推動(dòng)草木樨屬牧草種子生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于新疆阿拉爾市科克庫勒鎮(zhèn)(81°19′ E,40°35′ N)。屬暖溫帶極端大陸性干旱荒漠氣候，干旱少雨，蒸發(fā)強(qiáng)烈。該地年降雨量40.1～82.4 mm，年蒸發(fā)量≥2 100 mm，年日照時(shí)數(shù)2 556～2 991 h，無霜期200 d以上，平均氣溫7.5～11.7℃，>10℃年積溫3 800～4 700℃[16-17]。試驗(yàn)地前茬作物為甜高粱。

1.2 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為細(xì)齒草木樨新品系，屬一年生植物，原始群體為野生種質(zhì)資源，分布于新疆阿拉爾市。2019年4月20日播種，小區(qū)面積30.6 m2(5.1 m×6.0 m)，4個(gè)重復(fù)，條播，行距30 cm。理論播種量15 kg·hm-2(因土壤鹽堿，播種量提高)，播種深度1.3～1.5 cm。出苗后第10 d、第20 d、分枝期和初花期各漫灌一次。苗期人工除雜草2次。取樣時(shí)間分別為綠熟期、綠熟期+5 d、綠熟期+10 d、綠熟期+15 d、黃熟前期、黃熟前期+5 d、黃熟前期+10 d、黃熟前期+15 d、黃熟前期+20 d、黃熟后期、黃熟后期+5 d和完熟期，樣品編號分別為1～12號。取樣時(shí)避免邊行及兩頭50 cm之內(nèi)的植株，每小區(qū)按行從前到后的順序割取30株樣品，用于測定試驗(yàn)指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1種子結(jié)構(gòu) 分別選取綠熟期、黃熟前期、黃熟后期和完熟期[15]的代表性種子各3粒，用解剖針刺破種皮，置于蒸餾水中，于4℃冰箱中浸泡12 h，充分吸脹后，用10%甲醛溶液固定48 h，水洗48 h后，用酒精脫水，二甲苯透明。用YD-6D智能型生物組織包埋機(jī)進(jìn)行包埋，用LEICARM2235切片機(jī)切片(縱切)，厚度為10 μm，貼片和烤片后用伊紅-蘇木精染色[18]。在ECLIPSEE200型顯微鏡下觀察，并采集圖像。每張切片選取5個(gè)視角，用ImageJ軟件測定角質(zhì)層厚度、柵欄細(xì)胞層厚度、骨狀石細(xì)胞層厚度和糊粉層厚度，取平均值。對種子成熟過程中子葉細(xì)胞、胚根細(xì)胞和維管組織的變化規(guī)律進(jìn)行觀察和描述。

1.3.2種子的產(chǎn)量和質(zhì)量 脫粒和清選后稱取種子產(chǎn)量。隨機(jī)選取1 000粒種子，測定千粒重。將同一成熟階段不同重復(fù)的種子充分混勻，測定生活力、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實(shí)率。種子的生活力參照《草種子檢驗(yàn)規(guī)程生活力的生物化學(xué)(四唑)測定(GB/T 2930.5-2017)》[19]進(jìn)行測定，隨機(jī)數(shù)取400粒種子，每重復(fù)100粒，刺破種皮后，浸入1%的四唑溶液，30℃黑暗條件下浸泡18 h后取出，統(tǒng)計(jì)生活力百分率。參照《草種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽實(shí)驗(yàn)(GB/T 2930.4-2017)》[20]測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實(shí)率，隨機(jī)數(shù)取400粒種子，每重復(fù)100粒，整齊擺放在直徑為12 cm，鋪有1張濾紙的培養(yǎng)皿中，置于溫度為20℃，光照強(qiáng)度為4 400 lx，光暗周期為12 h/12 h的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，期間保持濾紙濕潤，第4天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和硬實(shí)率。用Seedburo電動(dòng)種子劃痕機(jī)(實(shí)驗(yàn)用)對種子進(jìn)行劃痕處理后，按上述方法再次測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實(shí)率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。分別用SPSS 19.0中的Duncan氏新復(fù)極差法和Pearson相關(guān)性分析法對不同收獲期細(xì)齒草木樨種子的種皮、產(chǎn)量和質(zhì)量性狀進(jìn)行差異顯著性分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟過程中細(xì)齒草木樨種子結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律

2.1.1成熟過程中細(xì)齒草木樨種皮結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律 由圖1可知，盡管不同成熟階段細(xì)齒草木樨的種皮結(jié)構(gòu)不盡相同，但總體上可分為角質(zhì)層、柵欄細(xì)胞層、骨狀石細(xì)胞層和糊粉層。角質(zhì)層位于種皮的最外層。柵欄細(xì)胞冠與角質(zhì)層緊密相連，呈蓮花狀排列，接著是明線和柵欄細(xì)胞腔，柵欄細(xì)胞呈籬笆狀，與表皮細(xì)胞垂直，分布均勻，排列緊密。骨狀石細(xì)胞層與柵欄細(xì)胞層緊密相連，有較大的細(xì)胞間隙。隨著種子成熟，骨狀石細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，與骨狀石細(xì)胞層相連的是糊粉層。由表1可知，不同成熟階段角質(zhì)層厚度介于5.23～6.86 μm之間，其在綠熟期最大，黃熟前期次之，然后是黃熟后期和完熟期，隨著種子成熟呈降低的變化趨勢，但不同成熟階段角質(zhì)層厚度差異不顯著。柵欄細(xì)胞層厚度介于50.42～54.98 μm之間，隨著種子成熟呈增加的變化趨勢，其在完熟期最大，極顯著高于綠熟期(P<0.01)，顯著高于黃熟前期和黃熟后期(P<0.05)。骨狀石細(xì)胞層厚度介于17.96～26.01 μm之間，其在完熟期最大，黃熟后期次之，然后是黃熟前期和綠熟期，隨著種子成熟呈上升的變化趨勢，但不同成熟階段骨狀石細(xì)胞層厚度差異不顯著。糊粉層厚度介于10.81～17.68 μm之間，其在完熟期最大，綠熟期最小，顯著低于其它成熟階段(P<0.05)。

圖1 不同成熟階段細(xì)齒草木樨的種皮結(jié)構(gòu)Fig.1 Seed coat structures of Melilotus dentatus in different mature stages注：A1-A4分別為綠熟期、黃熟前期、黃熟后期和完熟期的種皮結(jié)構(gòu)。C-角質(zhì)層，PCL-柵欄細(xì)胞層，OCL-骨狀石細(xì)胞層，AL-糊粉層，CPC-柵欄細(xì)胞冠，LL-明線，LPC-柵欄細(xì)胞腔Note:A1-A4 were seed coat structures in green,early yellow,late yellow and full ripe stages,respectively. C-Cuticle,PCL-Palisade cell layer,OCL-Osteosclerid cell layer,AL-Aleurone layer,CPC-Cap of palisade cell,LL-Light line,LPC-Lumen of palisade cell

2.1.2成熟過程中細(xì)齒草木樨種子子葉細(xì)胞和胚根細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律 細(xì)齒草木樨為雙子葉植物，早在綠熟期，子葉中已積累大量的貯藏物質(zhì)(圖2-B1)。從黃熟前期到黃熟后期和完熟期，子葉中細(xì)胞明顯變大(圖2-B2，B3，B4)。綠熟期胚根細(xì)胞的形態(tài)不規(guī)則，呈多邊形或圓形，部分細(xì)胞發(fā)生分裂，形成新的細(xì)胞(圖2-C1)。黃熟前期發(fā)生分裂的細(xì)胞數(shù)量大幅增加，分裂后的細(xì)胞形態(tài)變?yōu)闂l形(圖2-C2)。完熟期胚根中大部分細(xì)胞發(fā)生分裂，分裂后細(xì)胞呈玉米粒狀排列(圖2-C4)。

表1 不同成熟階段細(xì)齒草木樨種皮的徑向切面參數(shù)Table 1 Radial section parameters of seed coat of Melilotus dentatus in different mature stages

圖2 不同成熟階段細(xì)齒草木樨種子子葉和胚根中的細(xì)胞和維管束Fig.2 Cells and vascular bundles in seed cotyledon and radicle root of Melilotus dentatus in different mature stages注：B1-B4分別為綠熟期、黃熟前期、黃熟后期和完熟期種子子葉中的細(xì)胞和維管束，圖中VB表示維管束；C1-C4和D1-D4分別為上述4個(gè)成熟階段胚根中的細(xì)胞和維管束Note:B1-B4 were cells and vascular bundles of seed cotyledon in green,early yellow,late yellow and full ripe stages,respectively,on which vascular bundles were marked with VB;C1-C4and D1-D4were cells and vascular bundles of seed radicle root in above four mature stages,respectively

早在綠熟期子葉和胚根中均已分化出維管組織，形成維管系統(tǒng)的雛形，但維管組織長度較短，時(shí)斷時(shí)續(xù)，間隙較大(圖2-B1，圖2-D1)。黃熟后期維管組織變長，間隙變小，至完熟期維管組織再次伸長，相互連接構(gòu)成了完整和連貫的維管系統(tǒng)(圖2-B3，B4；圖2-D3，D4)。

2.2 成熟過程中細(xì)齒草木樨種子產(chǎn)量和千粒重的變化規(guī)律

供試樣品的編號及其產(chǎn)量和質(zhì)量指標(biāo)如表2所示。隨著種子成熟，細(xì)齒草木樨的產(chǎn)量和千粒重呈上升的變化趨勢，種子產(chǎn)量介于12.32～73.85 g·(30株)-1之間，完熟期12號樣品的產(chǎn)量最高，顯著高于黃熟后期前取的1～9號樣品(P<0.05)，極顯著高于1～8號樣品(P<0.01)。成熟早期1～5號樣品的種子產(chǎn)量介于12.32～19.26 g·(30株)-1之間，彼此間差異不顯著，但顯著低于黃熟前期后取的6～12號樣品(P<0.05)。不同成熟階段樣品的千粒重介于1.35～2.96 g之間，完熟期12號樣品的千粒重最高，極顯著高于1～10號樣品(P<0.01)。而1號和3號樣品的千粒重較低，顯著低于其它樣品(P<0.05)。

表2 不同成熟階段細(xì)齒草木樨種子的產(chǎn)量和質(zhì)量指標(biāo)Table 2 Seed yield and quality indexes of Melilotus dentatus in different mature stages

2.3 成熟過程中細(xì)齒草木樨種子生活力、發(fā)芽力和硬實(shí)率的變化規(guī)律

隨著成熟，細(xì)齒草木樨種子生活力和硬實(shí)率呈上升的變化趨勢，發(fā)芽勢和發(fā)芽率呈先升后降的變化趨勢。供試樣品的生活力百分率介于48.75%～100.00%之間，完熟期12號樣品的生活力百分率最高，極顯著高于1～10號樣品(P<0.01)，顯著高于11號樣品(P<0.05)。而成熟早期1號和2號樣品的生活力百分率最低，極顯著低于3～12號樣品(P<0.01)。供試樣品的發(fā)芽勢介于2.25%～17.00%之間，發(fā)芽率介于3.25%～19.75%之間，其中黃熟前期后5 d取的6號樣品發(fā)芽勢和發(fā)芽率最高，極顯著高于其它供試樣品(P<0.01)。而成熟早期1號、2號、3號和成熟晚期11號和12號樣品的發(fā)芽勢和發(fā)芽率較低。供試樣品的硬實(shí)率介于38.25%～87.25%之間，成熟晚期12號和11號樣品的硬實(shí)率分別為87.25%和85.25%，極顯著高于1～10號樣品(P<0.01)。成熟早期1～4號樣品的硬實(shí)率較低，分別為38.25%，41.50%，41.50%和43.00%，極顯著低于其它供試樣品(P<0.01)。

2.4 劃痕后細(xì)齒草木樨種子發(fā)芽力和硬實(shí)率的變化規(guī)律

劃痕處理后，1～12號樣品的發(fā)芽勢介于28.00%～96.00%之間，發(fā)芽率介于33.00%～96.75%之間。完熟期12號樣品的發(fā)芽勢和發(fā)芽率仍然最高，極顯著高于1～11號樣品(P<0.01)。而綠熟期1號樣品的發(fā)芽勢和發(fā)芽率最低，極顯著低于2～12號樣品(P<0.01)。

2.5 相關(guān)性分析

由表3可知，細(xì)齒草木樨種子的硬實(shí)率與骨狀石細(xì)胞層厚度、種子產(chǎn)量、千粒重、生活力百分率呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與柵欄狀細(xì)胞層厚度、糊粉層厚度、發(fā)芽勢和發(fā)芽率呈正相關(guān)關(guān)系，與角質(zhì)層厚度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。種子的生活力百分率與發(fā)芽勢和發(fā)芽率呈正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)較小。

表3 細(xì)齒草木樨種皮、產(chǎn)量和質(zhì)量性狀的相關(guān)性Table 3 Correlation of seed coat,yield and quality traits of Melilotus dentatus

3 討論

3.1 細(xì)齒草木樨發(fā)芽力的影響因素分析

本研究發(fā)現(xiàn)在自然狀態(tài)下細(xì)齒草木樨種子的發(fā)芽率較低，但經(jīng)劃痕處理后，發(fā)芽率大幅提高，這種情況與黃花草木樨[8]、白花草木樨[9]、苦豆子(SophoraalopecuroidesLinn.)、苦馬豆(Sphaerophysasalsula(Pall.) DC.)、脹果甘草(GlycyrrhizainflataBatal.)[21]和草木樨狀黃芪(AstragalusmelilotoidesPall.)[22]等豆科植物類似。因此，細(xì)齒草木樨的種皮硬實(shí)是影響種子發(fā)芽的主要因素。種皮是種子最外的保護(hù)層，由胚珠和珠被發(fā)育而成，不含原生質(zhì)，均為無生命的死細(xì)胞[15]。崔芬芬等[23]認(rèn)為種皮的角質(zhì)層和柵欄細(xì)胞層可能是影響種皮硬實(shí)的主要因素。Bevilacqua等[24]和胡小文等[25]認(rèn)為柵欄細(xì)胞層主要影響種皮硬實(shí)，而桂喆和孫海群[8]及Graaff等[26]認(rèn)為除柵欄細(xì)胞層外，骨狀石細(xì)胞層也是影響種皮硬實(shí)的主要因素。本研究結(jié)果表明，從綠熟期到完熟期，種子?xùn)艡诩?xì)胞層厚度和骨狀石細(xì)胞層厚度呈持續(xù)上升的變化趨勢，相關(guān)性分析結(jié)果表明種子的硬實(shí)率與骨狀石細(xì)胞層厚度呈顯著正相關(guān)，與柵欄狀細(xì)胞層厚度呈正相關(guān)。據(jù)此判斷，柵欄細(xì)胞層和骨狀石細(xì)胞層可能都是影響細(xì)齒草木樨種皮硬實(shí)的主要因素。

3.2 成熟過程中細(xì)齒草木樨種子產(chǎn)量和質(zhì)量的變化規(guī)律分析

本研究結(jié)果表明，隨著種子成熟，細(xì)齒草木樨種子的千粒重呈上升的變化趨勢，這與耿本仁和王金玲[27]研究白花草木樨的結(jié)果一致，表明細(xì)齒草木樨和白花草木樨種子的干物質(zhì)在成熟過程中不斷積累。細(xì)齒草木樨種子的產(chǎn)量也呈上升的變化趨勢，完熟期達(dá)到最高，顯著高于其它成熟階段(P<0.05)，而李鴻祥等[9]的研究結(jié)果表明，白花草木樨的種子產(chǎn)量隨著成熟呈先升后降的變化趨勢，這種差異可能是由于與白花草木樨種質(zhì)資源相比，細(xì)齒草木樨落粒性相對較小。種子的生活力、發(fā)芽率和硬實(shí)率是影響種子質(zhì)量的重要因素。通常生活力越高，種子適應(yīng)不良環(huán)境的能力越強(qiáng)，生活力低，則種子出苗不整齊，甚至不能出苗[28-30]。本研究結(jié)果顯示，隨著成熟，細(xì)齒草木樨種子結(jié)構(gòu)逐漸完善，生活力呈上升的變化趨勢，這與高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev.)[31]、垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb.)[32]和春小麥(TriticumaestivumL.)[33]種子成熟過程中生活力的變化趨勢相同，但由于種子趨于硬實(shí)，發(fā)芽勢和發(fā)芽率并未隨生活力的增加而持續(xù)上升。本研究中細(xì)齒草木樨種子的硬實(shí)率極高，可能與其原始群體的野生性狀有關(guān)，這與桂喆和孫海群[8]研究野生白花草木樨、黃花草木樨、廣布野豌豆(ViciacraccaL.)、箭筈豌豆(ViciasativaL.)、高山豆(Tibetiahimalaica(Baker) Tsui.)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)時(shí)所得結(jié)論一致。

3.3 細(xì)齒草木樨適宜的收獲時(shí)間及解除硬實(shí)的必要性分析

由于細(xì)齒草木樨種子的硬實(shí)率過高，導(dǎo)致不同成熟階段種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率普遍較低，最大值僅為17.00%和19.75%，用作播種材料時(shí)，必須先破除種皮硬實(shí)。經(jīng)劃痕處理后，種子的產(chǎn)量、千粒重、發(fā)芽勢和發(fā)芽率的最大值均出現(xiàn)在完熟期。因此，完熟期為細(xì)齒草木樨種子最適宜的收獲時(shí)間。大量研究表明，砂紙打磨和硫酸浸泡可大幅提高豆科植物的發(fā)芽率[34-36]，但前者過于耗時(shí)費(fèi)力，后者所需硫酸數(shù)量過多，加之購買困難，危險(xiǎn)性過高，用于生產(chǎn)尚有缺陷。由于一年生牧草每年需要重新播種，其流通方式與多年生牧草不同，農(nóng)戶通常采用自產(chǎn)留種的方式繁殖種子。因此，簡易的硬實(shí)破除方法尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

種皮硬實(shí)嚴(yán)重抑制了細(xì)齒草木樨種子發(fā)芽，柵欄細(xì)胞層和骨狀石細(xì)胞層可能是影響細(xì)齒草木樨種皮硬實(shí)的主要因素。隨著種子成熟，細(xì)齒草木樨的產(chǎn)量、千粒重和硬實(shí)率呈上升的變化趨勢，發(fā)芽勢和發(fā)芽率呈先升后降的變化趨勢。細(xì)齒草木樨在新疆阿拉爾市最適宜的收獲時(shí)間為完熟期，用作播種材料時(shí)，必須要先破除硬實(shí)。